Los linfocitos CD8+ no afectan el establecimiento del reservorio de VIS bajo ART

Nature Microbiology volumen 8, páginas 299–308 (2023)Cite este artículo

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La persistencia del reservorio latente del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) en individuos infectados sigue siendo un problema a pesar de la terapia antirretroviral (TAR) totalmente supresora. Si bien la formación de reservorios comienza durante la infección aguda, los mecanismos responsables de su establecimiento siguen sin estar claros. Las células T CD8+ son importantes durante el control inicial de la replicación viral. Aquí examinamos el efecto de las células T CD8+ en la formación del reservorio latente en macacos infectados por el virus de la inmunodeficiencia simia (VIS) realizando una reducción experimental de CD8+ ya sea antes de la infección o antes del inicio temprano del TAR (es decir, el día 14 después de la infección). Encontramos que el agotamiento de CD8+ resultó en una disminución más lenta de la viremia, lo que indica que los linfocitos CD8+ reducen la vida útil promedio de las células infectadas productivamente durante la infección aguda y el TAR temprano, presumiblemente a través de la actividad de los linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos del VIS. Sin embargo, el agotamiento de CD8+ no cambió la frecuencia de células T CD4+ infectadas en la sangre o en los ganglios linfáticos, medida por el ADN viral asociado a células totales o el ensayo de ADN de provirus intacto. Además, el tamaño del reservorio persistente permaneció igual al medir la cinética del rebote del virus después de la interrupción del TAR. Estos datos indican que durante la infección temprana por VIS, el reservorio viral que persiste bajo el TAR se establece en gran medida independientemente del control de los CTL.

La barrera crítica para una cura del VIH es una población de células infectadas de forma latente que albergan un virus integrado con capacidad de replicación (es decir, un "reservorio viral") que persiste indefinidamente en personas infectadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) tratadas con terapia antirretroviral (TAR)1. 2,3. Los mecanismos responsables del establecimiento y mantenimiento del reservorio aún no se comprenden completamente tanto en la infección por VIH en humanos como en la infección por el virus de la inmunodeficiencia simia (VIS) en macacos rhesus (Macaca mulatta, RM), que representa el modelo de primates no humanos más utilizado para el VIH. Infección y SIDA4.

Muchas líneas de evidencia indican que la actividad de los linfocitos T citotóxicos (CTL) mediada por células T CD8+ juega un papel importante en el control de la replicación del virus durante la infección aguda por VIH/VIS5. En primer lugar, la disminución de la viremia posterior al pico se produce después de la aparición de células T CD8+ específicas del virus, lo que sugiere que estas células están involucradas en el control inicial de la replicación viral6,7. En segundo lugar, los mutantes virales capaces de escapar de la respuesta de las células T CD8+ se fijan rápidamente en la población del virus, lo que demuestra una fuerte presión evolutiva impuesta sobre el virus por las células T CD8+8,9,10,11. En tercer lugar, el agotamiento de las células T CD8+ durante la infección aguda por VIS da como resultado la anulación de la disminución de la viremia posterior al pico12,13. Es de destacar que estudios recientes también sugieren que las células T CD8+ inhiben la producción de virus a través de mecanismos no citolíticos que suprimen la transcripción del VIH/VIS14,15, lo que conduce a un nuevo paradigma según el cual las células T CD8+ controlan la viremia a través de CTL "canónicos" y no -supresión citolítica de la producción de virus5.

En este estudio, utilizamos el sistema experimental in vivo previamente validado de agotamiento de linfocitos CD8+ mediado por anticuerpos16,17 para estudiar los mecanismos responsables del establecimiento del reservorio del virus en MR tratados con ART infectados con VIS. El resultado clave de este estudio es que los linfocitos CD8+ no afectan el establecimiento del reservorio de VIS bajo ART.

En el estudio actual, 21 MR adultos de origen indio (Tabla de datos ampliados 1) se infectaron por vía intravenosa (iv) con 10 000 UI de SIVmac239M con código de barras que contenía ~10 000 clonotipos en proporciones aproximadamente iguales18 y un régimen de TAR estándar (Tenofovir/TDF, Emtricitabina /FTC, Dolutegravir/DTG) se inició el día 14 después de la infección (pi). Los RM se dividieron en tres grupos (Fig. 1a): (1) 8 animales recibieron una dosis única de 50 mg kg-1 del anticuerpo anti-CD8α, MT807R1, 1 día antes de la infección por VIS (Grupo-1: Pre- infección, agotamiento de CD8+); (2) 8 animales recibieron MT807R1 1 día antes del inicio del TAR (Grupo 2: agotamiento de CD8+ previo al TAR); y (3) 5 animales sirvieron como controles (Grupo-3). Todos los MR fueron tratados con TAR durante 50 semanas y luego se sometieron a una interrupción analítica del tratamiento (ATI), después de lo cual fueron monitoreados durante 12 semanas antes de la necropsia.

a, Diseño del estudio. b, Cinética de las células T CD8+ en sangre periférica después del agotamiento. c,d, Análisis de citometría de flujo longitudinal de la expresión de Ki-67 (c) o PD-1 (d) en células T CD8+ en masa después del agotamiento de las células T CD8+ en el grupo de agotamiento previo a la infección (n = 8 macacos, línea magenta) , Grupo Pre-ART (n = 8 macacos, línea verde azulado) y en el grupo de control (n = 5 macacos, línea negra). e, carga viral plasmática de VIS en los primeros 120 días pi en los tres grupos experimentales (n = 21 macacos). El límite de detección es 60 copias de ARN del VIS por ml de plasma (línea de puntos horizontal). f, Comparación de la carga viral en plasma entre los 3 grupos en los días 14 y 21 (lado izquierdo) y los días 28 y 35 (lado derecho). g, Tasa de disminución de la carga viral en 7 días. En a-e: la flecha azul indica infección por SIVmac239M; Las flechas roja y naranja indican la administración de 50 mg kg-1 de MT807R1 antes de la infección o el inicio del TAR, respectivamente. El cuadro gris representa el tiempo en ART. En b – e: los datos son media ± sem Se utilizó la prueba de Kruskal Wallis para comparar los valores entre los grupos. En b-g: los cuadrados/líneas magenta representan el grupo Pre-Infección (n = 8 macacos), los triángulos/líneas verde azulado representan el grupo Pre-ART (n = 8 macacos), los círculos/líneas negros representan el grupo de control (n = 5 macacos). En f y g: la barra horizontal de cada grupo representa la media. Se utilizó la prueba t de Welch bilateral para comparar los valores entre los grupos. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Datos fuente

Las decisiones de iniciar el TAR el día 14 pi y agotar los linfocitos CD8+ el día 13 pi en el grupo con depleción de CD8+ previo al TAR se basaron en estudios previos que identificaron la aparición de células T CD8 específicas de VIS y la presencia de presión de CTL (como medido por mutantes de escape en la cuasiespecie de virus predominante) a los 14 días pi11,19. En el estudio actual, cuantificamos las células T CD8+ específicas de SIV en el día 14 pi en el grupo no agotado mediante estimulación ex vivo con péptidos SIV y medimos la frecuencia de células T CD8+CD95+ que expresan Granzima B, CD107a, IL-2, TNF. -α e IFN-γ en respuesta a estos péptidos (datos ampliados, Fig. 1a, b). Como era de esperar, al examinar las células T CD8+ extraídas de los ganglios linfáticos (LN) de RM no agotados, así como las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un estudio anterior que también utilizó SIVmac239, encontramos que están presentes respuestas robustas de células T CD8+ específicas de SIV. el día 14 pi en todos los animales. Como tal, estos datos confirman que la ventana relativamente corta de exposición al antígeno in vivo (es decir, el día 0 al 14 pi) es suficiente para generar respuestas de células T CD8+ específicas del virus. De acuerdo con estudios previos16,17,20, el tratamiento con MT807R1 fue seguido por una rápida depleción del 99,7% al 99,8% de las células T CD8+ en la sangre en los grupos de depleción de CD8+ antes de la infección y antes del TAR en comparación con el valor inicial (Fig. 1b y datos ampliados Fig. 2a,b). En LN, donde no se disponía de una muestra inicial, los niveles de células T CD8+ después de la administración de MT807R1 fueron del 99,6% y del 95,3% en los grupos con depleción de CD8+ antes de la infección y antes del TAR, respectivamente, en comparación con los animales no agotados (Figura de datos ampliados). .2c). El agotamiento de los linfocitos CD8+ fue seguido por la repoblación de estas células el día 42 después de la administración de MT807R1 (Datos ampliados, Fig. 2d, e). Como se esperaba, la reconstitución de las células T CD8 + se asoció con un aumento de las frecuencias de células T CD8 + que expresan Ki-67 y PD-1 tanto en sangre como en LN (Fig. 1c, d y Datos ampliados Fig. 2f-i). Como se muestra en los datos ampliados de las figuras 3a a f, la mayoría de las células T CD8+ en repoblación se incluyeron en las subpoblaciones de memoria central (TCM) CD28+CD95+ o de memoria efectora (TEM) CD28-CD95+, con una reconstitución más lenta de CD28+CD95. − células vírgenes (TN). Es de destacar que el agotamiento de los linfocitos CD8+ no se asoció con cambios importantes en los niveles de células T CD4+ circulantes en comparación con los animales no agotados (Datos ampliados, Fig. 4a). De manera similar, no observamos ningún cambio significativo entre los grupos en la fracción de células T CD4 + circulantes o basadas en LN que expresan Ki-67 (Datos ampliados, Fig. 4b, c), o en la fracción de TN CD4 + circulantes o basadas en LN o Células TCM (datos ampliados, figuras 5a a f). Por el contrario, se observó un aumento moderado pero significativo en la fracción de CD4 + TEM tanto en sangre como en LN de RM que pertenecen al grupo de agotamiento de CD8 + "preinfección" (Datos ampliados, figuras 5c, f – h).

En el momento del inicio del TAR (día 14 pi), todos los MR mostraron viremia plasmática similar (Fig. 1e y Datos ampliados Fig. 6a, b), consistente con un estudio previo21, y un rango similar de diversidad de códigos de barras (Datos ampliados Fig. 6c). Sin embargo, la medición cuantitativa longitudinal de la viremia durante las primeras 3 semanas de TAR reveló una disminución más lenta en los MR de los Grupos 1-2 (es decir, agotamiento de CD8 + previo a la infección y previo al TAR) (Fig. 1e), en comparación con los controles. En particular, encontramos que la viremia en los días 21, 28 y 35 pi (es decir, los días 7, 14 y 21 desde el inicio del TAR) fue significativamente mayor en los grupos con depleción de CD8 + en comparación con los controles (Fig. 1f). De manera similar, las tasas de disminución de la carga viral a los 7 días entre los días 0 y 7 después del inicio del TAR y los días 14 y 21 después del inicio del TAR fueron significativamente más bajas en los grupos con depleción de CD8 + en comparación con los controles (Fig. 1g). A pesar de esta disminución más lenta de la viremia, todos los MR alcanzaron la supresión virológica completa dentro de los 5 meses posteriores al TAR, con una viremia por debajo de 60 copias por ml de plasma (Datos ampliados, figura 6b).

Los estudios clásicos de la dinámica viral después del TAR demostraron una caída bifásica de la viremia22,23,24. La mayor parte del virus plasmático es producida por células infectadas productivamente de vida corta (t1/2 ~ 1 día), mientras que una segunda población con una vida media del orden de semanas hace una contribución menor a la viremia. Suponiendo que el TAR fue igualmente eficaz en la supresión de rondas de novo de replicación del VIS en todos los grupos, la observación de una disminución significativamente más lenta de la viremia después del TAR en MR empobrecidos en CD8+ indica que, en ausencia de células T CD8+, la vida útil in vivo de las células productivas Las células infectadas que producen la mayor parte del virus plasmático son más largas y/o el número de viriones producidos por célula infectada es mayor, presumiblemente debido a la eliminación experimental de la actividad CTL específica del VIS.

Para determinar el impacto del agotamiento de CD8+ en el tamaño del reservorio viral bajo TAR, luego medimos los niveles de ADN-VIS total asociado a células (CA) en células T CD4+ derivadas de sangre y LN durante los primeros 4 meses de tratamiento. . Como se muestra en la Fig. 2a,b y en los datos ampliados Fig. 7a,b, el agotamiento de las células T CD8+ no cambió la frecuencia de las células CA-DNA+ totales en el día 14 pi. Es importante destacar que la frecuencia de las células SIV-DNA+ disminuyó después del TAR con cinética similar en todos los grupos de RM, y convergieron a niveles similares en el día 116 y el día 56 de ART en sangre y LN, respectivamente (Fig. 2a, b y datos ampliados Fig. 7a, b). A continuación, medimos la tasa de disminución de las células T CD4+ CA SIV-DNA+ entre varios puntos temporales del TAR tanto en sangre (días 0 y 14; días 14 y 28; días 28 y 42) como en LN (días 0 y 14; días 14 y 28; días 28 y 56) y no encontró diferencias entre los grupos, excepto por el hallazgo aislado de una disminución más rápida entre los días 0 y 14 en el LN del grupo de agotamiento previo a la infección en comparación con los controles (Fig. 2c, d).

a,b, ADN asociado a células VIS en sangre periférica (a) y en ganglios linfáticos (b). c,d, tasa de disminución de CA-DNA entre varios puntos temporales después del inicio del TAR tanto en sangre periférica (días 0 y 14; días 14 y 28; días 28 y 42) (c) como en ganglios linfáticos (días 0 y 14; días 14 y 28; días 28 y 56) (d). e, f, ADN proviral intacto del VIS en sangre periférica (e) y ganglios linfáticos (f). g,h, Tasa de disminución del ADN proviral intacto entre varios puntos temporales después del inicio del TAR tanto en sangre periférica (días 0 y 28; días 28 y 56; días 56 y 105) (g) como en ganglios linfáticos (días 0 y 28; días 28 y 56; días 56 y 105) (h). i – k, Ajuste del modelo de los niveles de carga viral plasmática de VIS (i), CA-DNA (j) y CA-RNA (k). Las predicciones del modelo basado en grupos se muestran como líneas gruesas. Los datos de animales individuales se muestran como líneas finas. La línea discontinua gris en i indica el límite de detección. Para cada grupo, los parámetros (Tabla complementaria 2) se estimaron mediante un enfoque de modelado de efectos mixtos no lineal. En a–k: grupo de agotamiento previo a la infección (n = 8 macacos, cuadrados magenta/línea), grupo previo al TAR (n = 8 macacos, triángulos verde azulado/línea) y grupo de control (n = 5 macacos, círculos negros/línea ). En a, b, eyf: el triángulo azul indica infección por SIVmac239M, el triángulo rojo indica el agotamiento de las células T CD8+ antes de la infección y el triángulo naranja indica el agotamiento de las células T CD8+ antes del inicio del TAR. El cuadro gris representa ARTE. El análisis longitudinal después del agotamiento de las células T CD8+ se realizó en células T CD4+ derivadas de biopsias de sangre periférica y ganglios linfáticos. Los datos son media ± sem. Se utilizó la prueba de Kruskal Wallis para comparar los valores entre los grupos. En c, d, g y h: la barra horizontal de cada grupo representa la media. Se utilizó la prueba t de Welch bilateral para comparar los valores entre los grupos. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Para determinar a continuación el impacto del agotamiento de CD8+ en la fracción de células T CD4+ que albergan virus con capacidad de replicación, utilizamos una versión adaptada al SIV del ensayo de ADN de provirus intacto (IPDA) recientemente descrito25. Este ensayo representa un sustituto confiable para la medición directa de células que albergan virus con capacidad de replicación mediante un ensayo de crecimiento viral cuantitativo25, que no fue posible realizar debido al pequeño número de células recolectadas. Como se muestra en la Fig. 2e, f y en los datos ampliados Fig. 7c, d, la evaluación longitudinal de la frecuencia de células T IPDA+ CD4+ tanto en sangre como en LN reveló una cinética similar entre los dos grupos de RM y controles empobrecidos en CD8+. Además, comparamos la tasa de disminución de copias de ADN intactas de VIS por 106 células entre varios puntos de tiempo después del TAR tanto en sangre (días 0 y 28; días 28 y 56; días 56 y 105) como en LN (días 0 y 28; días 28 y 56; días 56 y 105) y nuevamente no encontró diferencias importantes entre los tres grupos, excepto por una disminución más rápida entre los días 56 y 105 en la sangre del grupo de agotamiento previo a la infección y en los ganglios linfáticos del grupo previo a la ART. grupo de agotamiento (Fig. 2g, h). Además, medimos, en los mismos momentos, la fracción de células T CD4+ que expresan provirus hipermutados utilizando el ensayo de ADN de provirus hipermutado (HPDA26) recientemente validado y nuevamente no encontramos diferencias significativas en la cinética de la disminución de células HPDA+ inducida por ART en los tres grupos (Datos ampliados Fig. 7e, f). En general, estos datos indican que el agotamiento de CD8+ realizado antes de la infección o antes del TAR no cambia la cinética de descomposición de las células infectadas en la sangre o LN.

El análisis descrito anteriormente sugiere que la depleción de linfocitos CD8+ se asocia con una disminución inicial más lenta de la viremia después del TAR. Sin embargo, observamos en macacos agotados y de control una disminución temprana similar del número total de células T CD4+ SIV-DNA+ y ningún efecto a largo plazo sobre las células T CD4+ SIV-DNA+ o las células T IPDA+ y HPDA+ CD4+. Una posible explicación es que las células de vida corta que producen la mayor parte del virus plasmático representan sólo una fracción del ADN del VIS circulante, que también incluye células de vida larga27. Por lo tanto, una pérdida más rápida de células de vida corta puede ser más difícil de detectar por encima de la alta proporción de células SIV-DNA+ de vida larga. Además, la mayoría de las células infectadas y la principal fuente de virus plasmático se encuentran probablemente en tejidos como la LN y el tejido linfoide asociado al intestino, que es un sitio importante de replicación viral y depleción de células T CD4+ en el modelo SIV28. Para cuantificar mejor la dinámica del virus después del TAR, desarrollamos un modelo matemático que incorpora una población de células infectadas productivamente de vida corta y una segunda población de células infectadas de forma latente de vida larga. El modelo incorporó diferentes esperanzas de vida para estas poblaciones, así como diferente producción viral por célula y sensibilidad diferencial a la focalización de CTL mediada por CD8. Ajustamos este modelo a los datos combinados sobre viremia, CA-RNA y CA-DNA a lo largo del tiempo para estimar los efectos de las células T CD8 + en las células infectadas de manera productiva y latente (Fig. 2i – k y Datos ampliados Fig. 8a – c). Este modelo reproduce la cinética esperada de dos fases de descomposición viral después del tratamiento, donde la primera fase representa una pérdida rápida de células de vida corta que producen altos niveles de virus. El ajuste de los parámetros del modelo muestra tres cambios significativos en la dinámica de la infección como resultado del agotamiento de CD8+. En primer lugar, el agotamiento de CD8+ afecta la dinámica de la infección en las primeras etapas de la infección, lo que lleva a una mayor fracción de células infectadas productivamente de vida corta en el momento del tratamiento (48,7 % para el grupo de control, 71,4 % y 76,0 % para el agotamiento previo a la infección y al agotamiento del TAR, respectivamente, P <0,001 para la comparación del control y cada grupo tratado) (Datos ampliados, Fig. 8a). Además, el agotamiento de las células T CD8+ se asoció con una tasa más lenta de muerte de las células infectadas productivamente (controles, 0,65 d-1 frente al agotamiento previo a la infección, 0,38 d-1 (P <0,001 frente al control) y agotamiento previo al TAR. 0,49 d−1 (P = 0,010 frente a control)) (Datos ampliados, figura 8b). Además, el agotamiento de CD8 condujo a un nivel más alto de producción promedio de virus en plasma por célula infectada de larga vida en animales agotados antes de la infección (controles, 5,2 × 104 copias de ARN de SIV ml-1/copias de ADN-CA por 106 células versus pre- infección, 1,86 × 105 (P <0,001 frente a control) y pre-TAR, 8,7 × 104 (P = 0,14 frente a controles)) (Datos ampliados, figura 8c).

La mayoría de las células infectadas detectadas al inicio del TAR y durante la fase de descomposición inicial no pasan a formar parte del reservorio latente estable27. En el estudio actual, no detectamos ningún efecto claro del agotamiento de CD8+ en esta población. Como evaluación funcional del impacto del agotamiento de CD8+ en el tamaño del reservorio, luego realizamos un ATI en la semana 50 después del inicio del TAR, es decir, cuando la viremia era indetectable en todos los animales tratados (Datos ampliados, figura 9a). Esta es la forma más sólida de evaluar la persistencia de una población clínicamente significativa de células infectadas de forma latente. Como se muestra en la Fig. 3a, todos los RM experimentaron un rebote de la viremia dentro de los 15 días posteriores a la ATI, y ningún animal mostró control de la viremia (Datos ampliados, Fig. 9a). Si bien el área bajo la curva de viremia no fue significativamente diferente entre los grupos, notamos una tendencia hacia una mayor replicación del virus después de la ATI en los MR que pertenecen al grupo 1 (es decir, agotamiento de CD8+ antes de la infección). Para determinar si esta tendencia podría atribuirse a una escasez de células T CD8+ específicas de SIV, evaluamos la frecuencia de células T CD8+CD95+ que expresan Granzima B, CD107a, IL-2, TNF-α e IFN-γ en respuesta a ex Estimulación vivo con péptidos SIV en PBMC recolectadas durante el TAR en las semanas 17 a 19 pi (Datos ampliados, figura 1c). Encontramos frecuencias similares de respuestas de células T CD8+ específicas de VIS entre los grupos con depleción de CD8+ y los controles, lo que sugiere que la exposición al antígeno después de la reconstitución de células T CD8+ es suficiente para generar respuestas específicas de péptidos de VIS incluso mientras los animales están en TAR. Como se esperaba, los niveles más altos de viremia observados después de la ATI se asociaron con un aumento detectable en la activación de las células T CD4+ y CD8+, medida por la fracción de células Ki-67+ (Datos ampliados, Fig. 9b, c). Para determinar cuantitativamente si y en qué medida el agotamiento de CD8+ afecta el rebote de la viremia después de ATI, utilizamos un método previamente descrito que integra la relación entre el número de copias de diferentes códigos de barras y la tasa de crecimiento del virus18,29. De acuerdo con la cinética similar del rebote viral, encontramos una tasa de reactivación (Fig. 3b) y una tasa de crecimiento por día de viremia (Fig. 3c) comparables entre todos los grupos. Además, encontramos que la carga viral de referencia no fue estadísticamente diferente entre los grupos (Fig. 3d). En conjunto, estos datos indican que el análisis de la cinética del rebote del virus después de la ATI como una evaluación funcional del tamaño total del reservorio de virus con capacidad de replicación no logró revelar ninguna diferencia estadísticamente significativa entre los animales agotados y no agotados. Como tal, este análisis confirma que el agotamiento de CD8+ realizado antes de la infección por VIS o inmediatamente antes del inicio del TAR no conduce a un reservorio ampliado.

a, Carga viral plasmática de VIS después de la interrupción del tratamiento hasta la necropsia en los tres grupos experimentales. El límite de detección es 60 copias de ARN del VIS por ml de plasma (línea de puntos horizontal). El cuadro gris representa ARTE. Los datos son media ± sem. Se utilizó la prueba de Kruskal Wallis para comparar los valores entre los grupos. b, Frecuencia de reactivación del virus después de la interrupción del tratamiento (estimada en función del número y tamaño de los clonotipos con código de barras observados). c, Tasa de crecimiento de la carga viral por día durante el rebote temprano. d, Carga viral de punto de ajuste (área bajo la curva de carga viral ponderada en el tiempo en los días 30 a 60 después de la detección viral). En a–d: grupo de agotamiento previo a la infección (n = 8 macacos, cuadrado/línea magenta), grupo de agotamiento previo al TAR (n = 8 macacos, triángulo verde azulado/línea) y grupo de control (n = 5 macacos, círculo negro/ línea). En b–d: las barras indican la mediana con rango intercuartílico. Se utilizó la prueba de Kruskal Wallis para comparar los valores entre los grupos.

El estudio actual mide experimentalmente el papel de los linfocitos CD8+ en el establecimiento del reservorio persistente bajo ART. El estudio involucró el agotamiento de CD8+ antes de la infección por VIS o inmediatamente antes del inicio del TAR, que se realizó el día 14 pi. Los principales resultados del estudio son que el agotamiento de CD8+ (1) se asocia con una vida útil más larga de las células infectadas productivamente y/o una mayor producción de virus. por célula, (2) no aumenta sustancialmente el tamaño de la población de células infectadas en sangre o LN medida por el total de células T CD4+ SIV-DNA+ y células que albergan provirus intactos y (3) no aumenta sustancialmente la tamaño del reservorio persistente evaluado funcionalmente mediante el análisis del rebote del virus después de ATI. Creemos que estos resultados representan un avance importante en nuestra comprensión de los mecanismos responsables del establecimiento del reservorio persistente bajo ART.

Dos estudios previos que involucraron el agotamiento de CD8+ en MR infectados con VIS al inicio del TAR indicaron que las células T CD8+ no reducen la vida útil de las células infectadas productivamente30,31; sin embargo, en estos estudios, el TAR se inició durante la infección crónica por VIS, es decir, cuando la eficacia de los CTL ya está afectada por el escape y el agotamiento viral. En el experimento actual, el TAR se inició durante la infección aguda, lo que representa el momento de máxima eficacia para la actividad de CTL específica del virus19,32,33,34. De acuerdo con este paradigma, observamos un efecto claro del agotamiento de CD8+ en la pendiente de la disminución de la viremia, que postulamos que está relacionado principalmente con la ablación de CTL específicos de VIS, que se sabe que reducen la replicación del virus durante las infecciones agudas por VIH/VIS. revisado en la referencia 5). Es de destacar que la posibilidad alternativa de que la disminución más lenta de la viremia observada en los grupos con depleción de CD8+ se debiera a un mayor número de virus que producen células T CD4+ 'activadas/proliferativas' (ya sea debido a estímulos homeostáticos o en respuesta a niveles más altos de antígeno) no se consideró. respaldado por la medición de células T CD4+Ki-67+. En este estudio, el impacto del agotamiento de CD8 en el nivel predominante de activación de las células T CD4+ parece menos dramático que en estudios previos15,20,35. Esta discrepancia parcial puede explicarse por el hecho de que en el experimento actual, los MR experimentaron un agotamiento de CD8 en un momento en el que la activación de las células T CD4+ también está influenciada tanto por la infección aguda por VIS como por el inicio del TAR, diluyendo así posiblemente el efecto directo del agotamiento de CD8+. sobre la activación de las células T CD4+.

La evidencia a favor de un papel importante de los CTL durante la infección aguda por VIH/VIS incluye las observaciones de que (1) las respuestas de las células T CD8+ específicas del virus se expanden durante la disminución de la viremia plasmática posterior al pico6,7; (2) las mutaciones de escape de los CTL del virus surgen en respuesta a la presión de las células T CD8+8,9,10,11; (3) los alelos específicos del MHC-I se asocian con una progresión más lenta de la enfermedad36,37; y (4) el fenotipo controlador de élite está asociado con CTL con polifuncionalidad, capacidad proliferativa y potencial de destrucción in vitro38,39,40,41. Como tal, la demostración formal de que la eliminación de la actividad CTL mediada por células T CD8+ durante la infección aguda por VIS da como resultado una vida útil más larga de las células infectadas productivamente y/o una mayor producción de virus por célula encaja muy bien con un gran conjunto de estudios experimentales. evidencia sobre el papel antiviral de los CTL.

Sin embargo, un hallazgo sorprendentemente inesperado del presente estudio es que el agotamiento de CD8+ no indujo un aumento significativo en el tamaño del reservorio latente persistente evaluado ya sea directamente o mediante análisis cinético del rebote de viremia después de ATI. Hay varias hipótesis, no mutuamente excluyentes, para explicar esta observación: (1) la mayor parte de las células que son destruidas por CTL están destinadas a morir de todos modos ya sea por efecto citopático mediado por virus y/o muerte celular inducida por activación; (2) la mayoría de las células que forman el reservorio persistente no experimentan niveles suficientes de producción de virus activo para ser objetivo de la actividad CTL; y (3) la mayoría de las células que forman el reservorio persistente no son el objetivo de los CTL debido a ubicaciones anatómicas/histológicas específicas y/o cambios fenotípicos específicos (es decir, modulación descendente de clase I). Si bien el experimento actual no abordó la contribución de cada uno de estos eventos potenciales, es notable cómo este estudio ha revelado una clara desconexión entre un poderoso papel de los CTL mediados por CD8+ en el control de la producción de virus y un papel en gran medida ineficaz en la prevención del establecimiento del virus. depósito bajo ART. Es de destacar que el experimento actual no abordó la posibilidad de que dicho efecto anti-reservorio de los CTL pueda lograrse mediante la vacunación antes de la infección o el uso de inhibidores de puntos de control, que será el tema de estudios adicionales.

Aunque todos los animales estaban suprimidos de forma duradera en el momento de la ATI, es formalmente posible que estuviera presente algún nivel de viremia residual (es decir, <60 copias por ml) y/o transitoria (es decir, en momentos en que no se realizó el muestreo). bajo TAR, como se muestra para la infección por VIH42,43,44. En este caso, la producción y/o replicación residual del virus también podría haber contribuido a la estabilidad observada del reservorio del virus.

En una serie de estudios recientes, demostramos que, además de los CTL restringidos por MHC de clase I, específicos de antígeno, las células T CD8+ suprimen la producción de VIH/VIS a través de un mecanismo no citolítico y no restringido por MHC-I, lo que resulta en potente inhibición de la transcripción del virus14,16. El papel desempeñado por la supresión transcripcional del SIV mediada por células T CD8+ en el experimento actual no está claro, ya que no hemos demostrado formalmente que este efecto esté presente in vivo durante las primeras etapas de la infección, ni hemos podido cuantificar su papel en la supresión de la replicación del virus en comparación con la actividad CTL canónica. Teóricamente, es posible que la eliminación de la supresión transcripcional mediada por células T CD8+ haya contribuido a la detección prolongada de células infectadas productivamente con VIS al promover la transcripción activa del virus y, por lo tanto, crear sinergia con el aumento de la esperanza de vida causado por la eliminación de CTL. Sin embargo, incluso en este escenario, el efecto de eliminar la supresión de la transcripción del VIS mediada por células T CD8+ retrasaría, pero no suprimiría, el establecimiento del reservorio persistente, a menos que esta actividad no citolítica dé como resultado un efecto favorable a la supervivencia aún no informado. de células productivamente infectadas con VIS. Por esta razón, la explicación más parsimoniosa de los resultados clave del presente estudio es que la supresión de la transcripción del VIS por parte de las células T CD8+ no es un determinante importante de los datos observados.

La posibilidad de que el reservorio persistente de VIH/VIS esté formado por células que nunca fueron susceptibles a la actividad de los CTL, independientemente de los mecanismos responsables (es decir, formación de latencia directa, santuario anatómico, eficiencia intrínseca deficiente de los CTL, etc.) tiene implicaciones importantes en términos de posibles enfoques terapéuticos para eliminar este reservorio. En este sentido, estamos planificando experimentos futuros en los que se estudiará la dinámica del establecimiento del reservorio utilizando el enfoque experimental actual (es decir, el agotamiento de CD8+ y el inicio temprano del TAR) en MR que fueron vacunados antes de la infección por VIS con vacunas que provocan CTL. Estudios adicionales que tengan como objetivo identificar los mecanismos moleculares y celulares específicos mediante los cuales el establecimiento temprano del reservorio persistente bajo ART es resistente a la actividad de CTL mediada por células T CD8+ pueden permitir el desarrollo de nuevas estrategias de base inmune que reducirán sustancialmente la tamaño de este reservorio en personas infectadas por VIH tratadas con ART.

Todos los experimentos con animales se realizaron siguiendo las pautas establecidas por la Ley de Bienestar Animal y por la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los NIH, octava edición. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Emory (número de permiso YER2003384). Las instalaciones de cuidado de animales del Centro Nacional de Investigación de Primates de Emory están acreditadas por el Departamento de Agricultura de EE. UU. y la Asociación Internacional para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio.

Este estudio incluyó 21 RM indios alojados en el Centro Nacional de Investigación de Primates Emory en Atlanta, Georgia (3 mujeres, 18 hombres; 3 a 4 años al inicio del estudio).

Todos los animales fueron Mamu*B08- y Mamu*B17-; los siguientes macacos fueron Mamu*A01+: RDm17, RSa17, RTz16, 34917, RPk17, 34896, RUn17, ROg18, RGa18.

Los MR se infectaron por vía intravenosa con 10.000 UI de SIVmac239M con código de barras que contenía alrededor de 10.000 clonotipos presentes en proporciones aproximadamente iguales18. Los macacos se estratificaron en tres grupos (Fig. 1a): 8 macacos recibieron una dosis del anticuerpo anti-CD8α, MT807R1, a 50 mg kg-1 1 día antes de la infección; 8 macacos recibieron la misma dosis de MT807R1 1 día antes de iniciar el TAR; 5 macacos sirvieron como grupo de control. A los 14 días pi, se inició una terapia antirretroviral (TAR) de triple formulación diaria en todos los RM, que consistía en dolutegravir (DTG; 2,5 mg kg-1 d-1, proporcionado por ViiV Pharmaceuticals), tenofovir disoproxil fumarato (TDF; 5,1 mg kg-1 −1 d−1, proporcionada por Gilead) y emtricitabina (FTC; 40 mg kg−1 d−1, proporcionada por Gilead) que se mantuvo hasta 50 semanas antes de la ATI. Después de la ATI, todos los animales fueron monitoreados durante 12 semanas antes de la necropsia.

Las biopsias de sangre periférica (PB) y NL (región axilar o inguinal) se realizaron longitudinalmente y en la necropsia como se describió anteriormente45. Brevemente, se utilizaron muestras de sangre para un hemograma completo y un análisis químico de rutina, y el plasma se separó mediante centrifugación dentro de 1 hora de la flebotomía. Las PBMC se aislaron de sangre completa mediante centrifugación en gradiente de densidad. Para las biopsias de NL, se cortó y preparó quirúrgicamente la piel sobre la región axilar o inguinal. Luego se hizo una incisión en la piel sobre la NL, que quedó expuesta mediante disección roma y se extirpó con pinzas. Luego se homogeneizaron los LN y se pasaron a través de un filtro celular de 70 um para aislar los linfocitos. Todas las muestras fueron procesadas, fijadas (1% de paraformaldehído) y analizadas dentro de las 24 h posteriores a su recolección.

La citometría de flujo multiparamétrica se realizó utilizando procedimientos estándar en PBMC y células mononucleares derivadas de biopsias de LN utilizando mAb antihumanos que previamente demostraron tener reactividad cruzada en RM16,45,46,47. Se utilizaron los siguientes anticuerpos a 37 °C durante 30 min: CCR5-BV650 (1:200, clon 3A9; BD Biosciences, 564999) y CCR7 FITC (1:200, clon 150503; BD Biosciences, 561271), además de LIVE /Colorante de viabilidad acuática DEAD (1 μl de dilución de PBS 1:20, Thermo Fisher, L34966). Luego se usaron los siguientes anticuerpos a temperatura ambiente durante 30 minutos: CD3-APC-Cy7 (1:200, clon SP34-2; BD Biosciences, 557757), CD4-BUV496 (1:200, clon SK3; BD Biosciences, 564651) , CD8α-BV711 (1:200, clon RPA-T8; Biolegend, 301044), CD8β-PE-Cy7 (1:200, clon SIDI8BEE; Invitrogen, 14-5273-82), CD45RA-Pe-Cy5 (1:200 , clon 5H9; BD Biosciences, 552888), CD62L-BV786 (1:200, clon SK11; BD Biosciences, 565311), CD95-BV605 (1:200, clon DX2; Biolegend, 305628), PD-1-BV421 (1 :200, clon EH12.2H7; Biolegend, 329920), CD14-BV510 (1:200, clon M5E2; Biolegend, 301842), CD20-BV510 (1:200, clon 2H7; Biolegend, 302340), NKG2A (también conocido como CD159a-APC) (1:200, clon Z199; Beckman Coulter, A60797), CD28-BUV737 (1:200, clon CD28.2; BD Biosciences, 612815), CD69-Pe-CF594 (1:200, clon FN50; BD Biosciences, 562617), CD25-BUV395 (1:200, clon 2A3; BD Biosciences, 564034) y HLA-DR-PerCP-Cy5.5 (1:200, clon G46-6; BD Biosciences, 552764). Después de la fijación y permeabilización con el kit de fijación/permeablización (BD Biosciences), las células se tiñeron con Ki-67-AF700 (1:200, clon B56; BD Biosciences, 561277) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Todos los anticuerpos se utilizaron siguiendo las recomendaciones de los fabricantes. La adquisición de datos se realizó en un LSR II (BD Biosciences) impulsado por el software FACS DiVa y se analizó utilizando el software FlowJo (versión 10.8; TreeStar).

Las cargas virales de VIS en plasma se determinaron mediante RT-PCR cuantitativa estándar con una sensibilidad de 60 copias por ml como se describió anteriormente48.

Las células T CD4+ se enriquecieron a partir de PBMC y células mononucleares derivadas de biopsias de ganglios linfáticos utilizando un kit de aislamiento de primates no humanos de células T CD4+ (Miltenyi Biotech) en una columna LS para todas las muestras siguiendo las especificaciones del fabricante. Luego, las células enriquecidas se dividieron en alícuotas en 1 millón o 5 millones de células T CD4+ y se lisaron en 350 µl de tampón de lisis Buffer RLT Plus RNeasy Plus (Qiagen) con 2-mercaptoetanol 1 mM (Sigma-Aldrich). El ADN y el ARN gag SIVmac239M asociados a células totales se cuantificaron como se describió anteriormente49,50. Brevemente, los niveles de ARN y ADN de SHIV asociados a células se midieron simultáneamente en células T CD4+ totales aisladas de PBMC y ganglios linfáticos (1.000.000 a 5.000.000 de células) lisadas en Buffer RLT Plus (Qiagen) más 2-mercaptoetanol. Tanto el ADN como el ARN se extrajeron utilizando el mini kit Allprep DNA/RNA (Qiagen). La cuantificación del ADN gag de SHIV se realizó en el ADN extraído mediante PCR cuantitativa utilizando el ensayo de nucleasa 5' (TaqMan) con un sistema ABI7500 (PerkinElmer). Para la cuantificación del número de células, se realizó una PCR cuantitativa simultáneamente con los números de copias del gen de albúmina de mono. El ARN se transcribió de forma inversa utilizando un kit de transcripción inversa (RT) de ADN complementario de alta capacidad (Thermo Fisher) y hexámeros aleatorios. La gag de SHIV y el gen CD4 del macaco rhesus se cuantificaron mediante qPCR del ADNc resultante utilizando la mezcla maestra universal II TaqMan (Thermo Fisher). Las secuencias de cebadores y sondas se detallan en la Tabla complementaria 6.

El ADN genómico se extrajo con un mini kit QIAamp DNA (Qiagen) a partir de células T CD4+ criopreservadas enriquecidas con PBMC y células mononucleares de ganglios linfáticos. IPDA y HPDA se realizaron como se describió anteriormente25,26. Brevemente, cada muestra se analizó por triplicado utilizando tres reacciones dúplex separadas: los ensayos SIV IPDA, RPP30 y env-2LTRc. El IPDA mide provirus intactos utilizando un amplicón en pol y uno en env, con 2 sondas marcadas que detectan provirus intactos y 2 sondas de competencia no marcadas que excluyen provirus con hipermutación de G a A. El ensayo RPP30 utiliza 2 amplicones en el gen RPP30 del huésped para medir y corregir el corte del ADN y también para cuantificar el número de células de entrada. Por último, el ensayo env-2LTRc mide círculos 2LTR no integrados duplicando el amplicón env IPDA con un amplicón específico para la unión LTR-LTR; Los eventos doblemente positivos de este ensayo se restan de los provirus intactos cuantificados utilizando el IPDA. Las reacciones se configuraron en un volumen total de 22 µl, con 10 µl de 2X Bio-Rad ddPCR Supermix (sin trifosfato de desoxiuridina), cebadores a una concentración final de 600 nM y sondas a 200 nM para los ensayos IPDA y env-2LTRc; o cebadores 500 nM y sondas 250 nM para el ensayo RPP30. Las secuencias de cebador y sonda se detallan en la Tabla complementaria 7. Las gotitas se prepararon utilizando el generador de gotas automatizado Bio-Rad QX200 y luego se sometieron a un ciclo térmico de acuerdo con el protocolo detallado en la Tabla complementaria 8. Las gotitas individuales se analizaron para determinar la fluorescencia de punto final utilizando Bio-Rad. Lector de gotas QX200. El análisis de los datos se realizó utilizando el software Quantasoft Studio. Los pozos con menos de 10.000 gotas fueron excluidos del análisis.

El ARN viral en plasma se cuantificó mediante RT-PCR antes de la secuenciación en un secuenciador Illumina MiSeq como se describió anteriormente18. Para muestras con plantilla baja, se utilizó la amplificación de un solo genoma (SGA), seguida de la secuenciación directa de Sanger para evaluar la frecuencia y el número de códigos de barras únicos.

Las PBMC criopreservadas y las células mononucleares de los ganglios linfáticos se descongelaron, se reposaron y se resuspendieron en medio RPMI 1640 (Corning) suplementado con FBS al 10% (Peak Serum), 100 U ml-1 de penicilina estreptomicina (Corning) y l-glutamina 2 mM (Gibco) en la presencia de CD107a-PEefluor660 (5 µl, clon H4A3; Invitrogen, 61-1079-42), CD49D (1 µl, clon 9F10; Invitrogen, 14-0499-82) y CD28-BUV737 (5 µl, clon CD28.2 ; BD Biosciences, 612815). Las células mononucleares se estimularon durante 6 h a 37 °C/5% de CO2 con péptidos Gag superpuestos SIVmac239 (NIH AIDS Reagent Program) a una concentración de 1 μg ml-1 en presencia de Brefeldin A (BD Biosciences, 555029) y monesina ( BD Biociencias, 554724). La estimulación con enterotoxinas estafilocócicas A y B (SEB/A-List Biologicals) a 250 ng ml-1 sirvió como control positivo. El diluyente peptídico (dimetilsulfóxido al 1%) sirvió como control negativo. Después de la estimulación, las células se lavaron y se tiñeron para detectar antígenos de la superficie celular con la siguiente combinación de mAb: CD3-Alexa700 (1:200, clon SP34-2; BD Biosciences, 557917), CD95-APC (1:200, clon DX2; BD Biosciences, 558814), CD4-BV711 (1:200, clon L200; BD Biosciences, 563913), CD8 PerCP-Cy5.5 (1:200, clon RPA-T8/SK1; Biolegend, 344710) y LIVE/DEAD Fixable Yellow (1 µl de dilución de PBS 1:15, Life Technologies, L34959). Para detectar la expresión intracelular de citocinas, las células mononucleares se fijaron y permeabilizaron con un kit de tampón de tinción FoxP3/factor de transcripción (Tonbo Biosciences) y se tiñeron de la siguiente manera: TNF-α-BV650 (1:100, clon Mab11; Biolegend, 502938), IL -2-PE-Cy7 (1:100, clon MQ1-17H12; Biolegend, 500307), IFN-γ-PE (1:100, clon B27; BD Biosciences, 554701) y Granzyme B-BV421 (1:100, BD Biociencias, 563389). Todos los mAb se utilizaron en el volumen de prueba recomendado por los fabricantes. La adquisición de datos se realizó en un BD FACSymphony (BD Biosciences) impulsado por el software FACS DiVa y se analizó utilizando el software FlowJo (versión 10.8; TreeStar). La frecuencia de las células T CD8+ de memoria específicas de SIV que producen citocinas individuales se determinó después de la resta de fondo.

La recopilación y el análisis de datos no se realizaron a ciegas con respecto a las condiciones de los experimentos. Según nuestros datos anteriores16 sobre MR tratados con TAR infectados con VIS, con un tamaño de muestra de al menos 8, podríamos detectar una diferencia significativa entre las muestras de agotamiento de CD8 antes y después de la depleción de CD8 en el nivel de ARN plasmático al 0,05. nivel de significancia con una potencia de 0,90. No se excluyeron animales ni puntos de datos de los análisis. La distribución de datos no fue probada formalmente. Los análisis estadísticos, incluida la prueba de Kruskal Wallis, la prueba t de Welch y la prueba de Mann Whitney, se realizaron utilizando GraphPad Prism v.9.0. Los datos presentados son media ± sem, a menos que se indique lo contrario. Se consideró estadísticamente significativo AP ≤ 0,05.

Se incorporó un enfoque de modelado de efectos mixtos para adaptar un modelo de desintegración de dos fases a los datos combinados de CA-DNA, CA-RNA y carga viral plasmática. Se utilizó el Criterio de información de Akaike (AIC) para comparar varias estructuras de modelos (es decir, efectos fijos específicos del grupo de tratamiento y efectos aleatorios asociados con diferentes parámetros del modelo), y se seleccionó el modelo con el AIC más bajo como modelo preferido. Consulte Información complementaria para obtener detalles sobre el modelo matemático y el ajuste del modelo.

La tasa de reactivación se estimó utilizando un modelo matemático desarrollado previamente18 basado en la relación entre la tasa de crecimiento viral y las cargas virales de diferentes clonotipos con códigos de barras. Los detalles del modelo matemático se presentan en la Información complementaria.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos sin procesar de todos los gráficos generados en este estudio se proporcionan en el archivo de información complementaria y datos de origen. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Palesch, D. y col. El tratamiento a corto plazo con interferón α2a pegilado no reduce significativamente el reservorio viral de los macacos rhesus infectados por el virus de la inmunodeficiencia de los simios y tratados con terapia antirretroviral. J. Virol. 92, e00279-18 (2018).

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Este trabajo fue apoyado por UM1AI164562, cofinanciado por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre, el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales, el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares, el Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas y el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (a GS, DAK, M. Paiardini) y NIH NIAID R01-AI143414 (a GS y DAK) y R01-AI125064 (a GS, AC, DAK)

Este proyecto fue financiado total o parcialmente con fondos federales del Instituto Nacional del Cáncer y los Institutos Nacionales de Salud bajo el Contrato No. 75N91019D00024/HHSN261201500003I. El contenido de esta publicación no refleja necesariamente las opiniones o políticas del Departamento de Salud y Servicios Humanos, y la mención de nombres comerciales, productos comerciales u organizaciones no implica respaldo por parte del gobierno de los EE. UU. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Agradecemos a B. Jones, V. García-Martínez y R. Sekaly por sus útiles discusiones; S. Ehnert, S. Jean y todo el personal veterinario y de cuidado de animales del Centro Nacional de Investigación de Primates de Emory; K. Gill en el Núcleo de citometría de flujo de la Universidad de Emory, el Núcleo de virología CFAR de Emory para cargas virales y el Núcleo de genómica de primates no humanos de Emory para secuenciación y análisis de ARN; K. Reimann y NHP Reagent Resources para el anticuerpo MT807R1; R. Geleziunas y Gilead Pharmaceuticals por proporcionar tenofovir y emtricitabina; y a J. Demarest y ViiV Healthcare por proporcionar Dolutegravir para este estudio.

Estos autores contribuyeron igualmente: Maura Statzu, Wang Jin, Emily J. Fray, Andrew Kam Ho Wong, Mithra R. Kumar.

Centro Nacional de Investigación de Primates Emory, Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio, y Centro de Vacunas Emory, Universidad Emory, Atlanta, GA, EE. UU.

Maura Statzu, Andrew Kam Ho Wong, Julia B. McBrien, Shan Liang, Justin L. Harper, Simona Mutascio, Lavinia Franchitti, Hong Wang, Davide Cicetti, Steven E. Bosinger, Diane G. Carnathan, Thomas H. Vanderford, Ann Chahroudi , Mirko Paiardini, Deanna A. Culpa y Guido Silvestri

Instituto Kirby, Universidad de Nueva Gales del Sur, Sydney, Australia

Wang Jin, Steffen S. Docken, Mykola Pinkevych y Miles P. Davenport

Departamento de Medicina, Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MD, EE. UU.

Emily J. Fray, Mithra R. Kumar, Elizabeth Ferrer, Janet Siliciano y Robert S. Siliciano

Programa de Virus del SIDA y el Cáncer, Laboratorio Nacional Frederick para la Investigación del Cáncer, Frederick, MD, EE. UU.

Christine M. Fennessey y Brandon F. Keele

División de Enfermedades Infecciosas, Centro para la Investigación del SIDA, Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, Facultad de Medicina, Chapel Hill, Carolina del Norte, EE. UU.

David M. Margolis & J. Victor Garcia-Martinez

Departamento de Pediatría, Universidad Emory, Atlanta, GA, EE. UU.

Ann Chahroudi

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AKHW, DAK, AC, M. Paiardini y GS diseñaron los experimentos. MS, AKHW, JBM y DGC realizaron los experimentos. THV y SL midieron la carga viral y el ADN y ARN asociados a las células. EJF, MRK y EF realizaron un ensayo de ADN de provirus intacto. BFK y CMF proporcionaron el virus con código de barras y realizaron la secuenciación del código de barras. JLH, SM, LF, HW, DC y SEB brindaron soporte técnico. WJ, SSD, M. Pinkevych y MPD contribuyeron al análisis, modelado y desarrollo conceptual. DMM, JVG-M., JS y RSS revisaron el manuscrito. MS, DAK y GS escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Guido Silvestri.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Microbiology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

La frecuencia de las células CD107a+, TNF-α+, IFN-γ+, IL-2+ y Granzima B+ se midió en células T CD8+ de memoria de sangre periférica (a; n = 6 macacos, círculo gris), ganglio linfático (b; n = 5 macacos, círculo negro) el día 14 después de la infección, y de sangre periférica durante el TAR a largo plazo (c). Para la Figura c: grupo de agotamiento previo a la infección (n = 8 macacos, cuadrado magenta), grupo de agotamiento previo al TAR (n = 8 macacos, triángulo verde azulado) y grupo de control (n = 5 macacos, círculo negro). La línea discontinua horizontal representa el límite de detección inferior.

a. La citometría de flujo representativa muestra la ausencia de células CD8β+ 7 días después del agotamiento en la sangre periférica. b. Comparación de la frecuencia de CD8β+ con la línea de base previa al agotamiento calculada en todos los macacos con depleción de CD8 (n = 16). Para las figuras c-i: el triángulo azul indica infección por SIVmac239M, el triángulo rojo indica el agotamiento de las células T CD8+ antes de la infección, el triángulo naranja indica el agotamiento de las células T CD8+ antes del inicio del TAR. El cuadro gris representa ARTE. C. Cinética de las células T CD8+ de los ganglios linfáticos en el grupo con depleción de CD8+ antes de la infección (n = 8 macacos, línea magenta), en el grupo con depleción de CD8+ antes del TAR (n = 8 macacos, línea verde azulado) y en el grupo de control (n = 5 macacos, línea negra ). Los datos son media ± sem. En las Figuras c-i: las líneas en cada gráfico representan animales individuales en cada grupo de estudio y se indican en clave debajo de cada columna de gráficos. d, e. Porcentaje longitudinal de células T CD8+ en sangre periférica (d), biopsias de ganglios linfáticos (e) en los tres grupos experimentales. fg. Análisis de citometría de flujo longitudinal de la expresión de Ki-67 en células T CD8+ en masa después del agotamiento de las células T CD8+ en sangre periférica (f) y biopsias de ganglios linfáticos (g). Hola. Análisis de citometría de flujo longitudinal de la expresión de PD-1 en células T CD8+ en masa después del agotamiento de las células T CD8+ en sangre periférica y biopsias de ganglios linfáticos.

Análisis de citometría de flujo longitudinal después del agotamiento de las células T CD8+ en el grupo de agotamiento de CD8+ antes de la infección (n = 8 macacos), el grupo de agotamiento de CD8+ antes del TAR (n = 8 macacos) y el grupo de control (n = 5 macacos). El triángulo azul indica infección por SIVmac239M, el triángulo rojo indica el agotamiento de las células T CD8+ antes de la infección, el triángulo naranja indica el agotamiento de las células T CD8+ antes del inicio del TAR. El cuadro gris representa ARTE. Las líneas en cada gráfico representan animales individuales en cada grupo de estudio y se indican en clave debajo de cada columna de gráficos. Porcentaje de células T CD28 + CD95− TN, CD28+CD95+ TCM y CD28−CD95+ TEM CD8+ en sangre periférica (ac) y ganglios linfáticos (d – f).

En las figuras a-c: el triángulo azul indica infección por SIVmac239M, el triángulo rojo indica el agotamiento de las células T CD8+ antes de la infección, el triángulo naranja indica el agotamiento de las células T CD8+ antes del inicio del TAR. El cuadro gris representa ARTE. a. Recuento de células T CD4+ en sangre periférica en el grupo con depleción de CD8+ antes de la infección (n = 8 macacos, línea magenta), en el grupo con depleción de CD8+ antes del TAR (n = 8 macacos, línea verde azulado) y en el grupo de control (n = 5 macacos, negro línea). Los datos son media ± sem. Se utilizó la prueba de Kruskal Wallis para comparar el valor entre los grupos. antes de Cristo. Las líneas en cada gráfico representan animales individuales en cada grupo de estudio y se indican en clave debajo de cada columna de gráficos. Análisis de citometría de flujo longitudinal después del agotamiento de las células T CD8+ Grupo de agotamiento de CD8+ antes de la infección (n = 8 macacos, línea magenta), grupo de agotamiento de CD8+ antes del TAR (n = 8 macacos, línea verde azulado) y grupo de control (n = 5 macacos, línea negro). Porcentaje de células T CD4+ a granel que expresan Ki-67 en sangre periférica (b) y ganglios linfáticos (c). * valor de p inferior a 0,05; ** Valor de p inferior a 0,01.

Análisis de citometría de flujo longitudinal después del agotamiento de las células T CD8+ en el grupo con agotamiento de CD8+ antes de la infección (n = 8 macacos, línea magenta), el grupo con agotamiento de CD8+ antes del TAR (n = 8 macacos, línea verde azulado) y el grupo de control (n = 5 macacos , línea negro). El triángulo azul indica infección por SIVmac239M, el triángulo rojo indica el agotamiento de las células T CD8+ antes de la infección, el triángulo naranja indica el agotamiento de las células T CD8+ antes del inicio del TAR. El cuadro gris representa ARTE. Las líneas en cada gráfico representan animales individuales en cada grupo de estudio y se indican en clave debajo de cada columna de gráficos. Porcentaje de células T CD28+CD95-TN, CD28+CD95+ TCM y CD28−CD95+ TEM CD4+ en sangre periférica (ac,g) y ganglios linfáticos (df,h). Para las Figuras g, h: Los datos son medias ± sem. Se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis para comparar los valores entre los grupos. * valor de p inferior a 0,05; ** Valor de p inferior a 0,01.

Para las Figuras a, b: carga viral plasmática de VIS en los tres grupos experimentales. El límite de detección es 60 copias de ARN del VIS por ml de plasma (línea discontinua horizontal). El triángulo azul indica infección por SIVmac239M, el triángulo rojo indica el agotamiento de las células T CD8+ antes de la infección, el triángulo naranja indica el agotamiento de las células T CD8+ antes del inicio del TAR. El cuadro gris representa ARTE. a. Viremia plasmática del VIS durante los primeros 120 días pi en los tres grupos experimentales. Las líneas en cada gráfico representan animales individuales en cada grupo de estudio y se indican en clave debajo de cada columna de gráficos. Para las Figuras b, c: los cuadrados/líneas magenta representan el grupo Pre-Infección (n = 8 macacos), los triángulos/líneas verde azulado representan el grupo Pre-ART (n = 8 macacos), los círculos/líneas negros representan el grupo de control (n = 5 macacos). b. Viremia plasmática del VIS hasta el día 210 pi en los tres grupos experimentales. Los datos son media ± sem. Se utilizaron pruebas de Kruskal-Wallis para comparar valores entre los grupos. C. Análisis de la diversidad de códigos de barras el día 14 después de la infección (en el momento del inicio del TAR). Los datos son media ± DE. Se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis para comparar valores entre los grupos. * valor de p inferior a 0,05; ** valor de p inferior a 0,01; *** valor de p inferior a 0,001; **** Valor de p inferior a 0,0001.

Análisis longitudinal después del agotamiento de las células T CD8+ en el grupo con agotamiento de CD8+ antes de la infección (n = 8 macacos, línea magenta), el grupo con agotamiento de CD8+ antes del TAR (n = 8 macacos, línea verde azulado) y el grupo de control (n = 5 macacos, negro línea). El triángulo azul indica infección por SIVmac239M, el triángulo rojo indica el agotamiento de las células T CD8+ antes de la infección, el triángulo naranja indica el agotamiento de las células T CD8+ antes del inicio del TAR. El cuadro gris representa ARTE. Las líneas en cada gráfico representan animales individuales en cada grupo de estudio y se indican en clave debajo de cada columna de gráficos. El ADN del VIS asociado a células y el ADN proviral intacto se determinaron en células T CD4+ derivadas de sangre periférica (a, c) y en ganglios linfáticos (b, d). mi, f. El ADN hipermutado (HM) del SIV se determinó en células T CD4+ derivadas de sangre periférica (e) y biopsias de ganglios linfáticos (f). Los datos son media ± sem. Se utilizaron pruebas de Kruskal-Wallis para comparar valores entre los grupos. * valor de p inferior a 0,05.

Para las Figuras a-c: los cuadrados/líneas magenta representan el grupo Pre-Infección (n = 8 macacos), los triángulos/líneas verde azulado representan el grupo Pre-ART (n = 8 macacos), los círculos/líneas negros representan el grupo de control (n = 5 macacos). a. Estimaciones del modelo de la proporción de células de vida corta y células de vida larga al inicio del TAR. Para cada grupo, la estimación del parámetro se presenta como la barra central que representa la estimación y los límites del cuadro que representan los límites superior e inferior del intervalo de confianza del 95%. Grupo Pre-Infección: 71,4% (IC 95% = 43,2%, 89,2%); Grupo pre-TAR: 76,0% (IC 95% = 48,9%, 91,3%); grupo control: 48,7% (IC 95% = 33,2%, 64,6%); p < 0,001 para la comparación del control y cada grupo tratado. Para las Figuras b, c: Las estimaciones de los parámetros se presentan como intervalos de confianza de efecto fijo ± 95 % del efecto fijo. b. Estimaciones de modelos de la tasa de disminución de células de vida corta. Grupo de control = 0,65 /día (IC del 95 % = 0,55, 0,76) versus grupo de agotamiento previo a la infección = 0,38 /día (IC del 95 % = 0,26, 0,55), (p < 0,001 frente a control) y grupo de agotamiento previo al TAR = 0,49 /día (IC 95% = 0,34, 0,72), (p = 0,010 vs. control) respectivamente. C. Estimaciones del modelo del virus plasmático por célula de larga vida. Grupo de control = 5,2 × 104 copias de ARN del VIS ml-1/(copia de ADN-CA/106 células) (IC del 95 % = 3,0 × 104, 9,1 × 104) versus preinfección = 1,86 × 105 (IC del 95 % = 5,4 × 104, 6,4 × 105) (p < 0,001 vs. control) y Pre-ART = 8,7 × 104 (IC 95% = 2,5 × 104, 3,0 × 105), (p = 0,14 vs. controles).

a. Cargas virales longitudinales en los tres grupos experimentales tras la interrupción del tratamiento. El límite de detección es 60 copias de ARN del VIS por ml de plasma (línea discontinua horizontal). El cuadro gris representa ARTE. Las líneas en cada gráfico representan animales individuales en cada grupo de estudio y se indican en clave debajo de cada columna de gráficos. antes de Cristo. Análisis de citometría de flujo longitudinal después de la interrupción del tratamiento en el grupo de agotamiento de CD8 + preinfección (n = 8 macacos, línea magenta), grupo de agotamiento de CD8 + pre-TAR (n = 8 macacos, línea verde azulado) y grupo de control (n = 5 macacos , línea negro). El cuadro gris representa ARTE. Porcentaje de células T CD8+ (b) o CD4+ (c) en masa que expresan Ki-67 en sangre periférica. Los datos son media ± sem. Se utilizaron pruebas de Kruskal-Wallis para comparar valores entre los grupos. * valor de p inferior a 0,05.

Métodos suplementarios sobre el modelo matemático, Figs. 1–6 y Tablas 1–8.

Archivo de Excel que contiene todos los datos de origen para cada elemento de Figura/Datos ampliados.

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Reimpresiones y permisos

Statzu, M., Jin, W., Fray, EJ et al. Los linfocitos CD8+ no afectan el establecimiento del reservorio de VIS bajo el TAR. Nat Microbiol 8, 299–308 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-022-01311-9

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Recibido: 28 de abril de 2022

Aceptado: 15 de diciembre de 2022

Publicado: 23 de enero de 2023

Fecha de emisión: febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-022-01311-9

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