Transmisión del SARS

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4078 (2023) Citar este artículo

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El SARS-CoV-2 es un virus zoonótico con transmisión bidireccional documentada entre personas y animales. La transmisión del SARS-CoV-2 de humanos a venados de cola blanca (Odocoileus virginianus) en libertad plantea un riesgo único para la salud pública debido al potencial de establecimiento de reservorios donde las variantes pueden persistir y evolucionar. Recolectamos 8.830 muestras respiratorias de venados de cola blanca en libertad en Washington, DC y 26 estados de los Estados Unidos entre noviembre de 2021 y abril de 2022. Obtuvimos 391 secuencias e identificamos 34 linajes de Pango, incluidos Alfa, Gamma, Delta y Omicron. variantes. Los análisis evolutivos mostraron que estos virus del venado de cola blanca se originaron a partir de al menos 109 contagios independientes de los humanos, lo que resultó en 39 casos de transmisión local posterior de venado a venado y tres casos de posible contagio del venado de cola blanca a los humanos. Los virus se adaptaron repetidamente al venado de cola blanca con sustituciones recurrentes de aminoácidos en las espigas y otras proteínas. En general, nuestros hallazgos sugieren que se introdujeron múltiples linajes de SARS-CoV-2, se volvieron enzoóticos y cocircularon en los venados de cola blanca.

El coronavirus-2 del síndrome de enfermedad respiratoria aguda grave (SARS-CoV-2) es un virus zoonótico1 similar a otros coronavirus de altas consecuencias, incluido el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo y el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio2. Desde su aparición en 2019, el SARS-CoV-2 ha evolucionado rápidamente y ha producido numerosas variantes genéticas del SARS-CoV-2, incluidas las variantes preocupantes (VOC) Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron3. Además de en humanos, se han documentado infecciones por SARS-CoV-2 en una amplia gama de animales salvajes, domésticos y exóticos en cautiverio, como ciervos4, visones5,6,7, ratas8, nutrias, hurones, hámsteres, gorilas y gatos. , perros, leones y tigres9. Además, la transmisión del SARS-CoV-2 de animales a humanos, aunque no es común, se ha documentado o sospechado en visones de granja (Neogale vison)5, 6, gatos domésticos (Felis catus)10 y venados de cola blanca (Odocoileus virginianus). 11, destacando a los animales como reservorios potenciales de infecciones zoonóticas secundarias. Un reservorio animal del SARS-CoV-2 se refiere a un huésped en el que el virus circula de manera encubierta, persiste en la población y puede transmitirse a otros animales o humanos, causando potencialmente brotes de enfermedades.

Los venados de cola blanca son comunes tanto en áreas urbanas como rurales de América del Norte con una población estimada de 30 millones distribuida en los Estados Unidos (EE. UU.). Damas et al. (2020) mostraron un alto grado de identidad de secuencia entre las proteínas de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) humana y del venado de cola blanca12, y los estudios de infección experimental demostraron que el virus SARS-CoV-2 similar (cepa Wuhan-Hu-1) puede infectan fácilmente a los venados de cola blanca y provocan una gran cantidad de diseminación viral y posterior propagación a congéneres ingenuos13,14,15. Chandler y cols. Estimó que el 40% de los venados de cola blanca analizados estuvieron expuestos al SARS-CoV-2, a partir de enero de 2020 en cuatro estados de EE. UU.16. Posteriormente, se notificaron infecciones activas por SARS-CoV-2, como lo demuestra la detección de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), en venados de cola blanca en los EE. UU. (es decir, Ohio4, Iowa17, Pensilvania18, Nueva York19) y Ontario. , Canadá11. Los virus reportados hasta la fecha en el venado de cola blanca son genéticamente diversos, incluidos los linajes Pango20 B.1.2 y B.1.311 en Iowa (período de muestreo, abril de 2020 a enero de 2021)17, B.1.2, B.1.582, B.1.596 en Ohio (enero a marzo de 2021)4, B.1.1.7 (Alfa), AY.88 (Delta), AY.5 (Delta) y AY.103 (Delta) en Pensilvania (enero a noviembre de 2021)18, B .1, B.1.1, B.1.2, B.1.243, B.1.409, B.1.507, B.1.517, B.1.1.7 (Alfa), B.1.1.28 (Gamma), P.1 (Gamma ), y B.1.617.2 (Delta) en Nueva York (septiembre de 2020 a diciembre de 2021)19, y B.1.641 (diciembre de 2021) en Ontario (noviembre a diciembre de 2021)11. Curiosamente, la mayoría de estos virus del venado de cola blanca estaban relacionados genéticamente con los que circulaban simultáneamente en los humanos. La identificación de virus genéticamente muy similares de múltiples animales capturados en dos días diferentes en el mismo lugar o en un lugar cercano sugirió que el SARS-CoV-2 probablemente se transmitió entre poblaciones de venados de cola blanca4, 19. Evidencia epidemiológica de la posible transmisión del SARS-CoV- 2 desde venados de cola blanca a personas en Canadá11.

En este trabajo, presentamos los resultados de una vigilancia a gran escala del SARS-CoV-2 en poblaciones de venados de cola blanca en libertad en los EE. UU. Nuestros objetivos eran comprender la diversidad genética del SARS-CoV-2 en venados de cola blanca en libertad, evaluar si el virus circulaba dentro de las poblaciones de venados de cola blanca y evaluar las frecuencias de transmisión asociadas con infecciones zoonóticas. En total, recolectamos 8830 hisopos nasales u orales de venado cola blanca en Washington, DC y 26 estados de EE. UU. desde finales del otoño de 2021 hasta principios de la primavera de 2022, lo que arrojó 944 muestras positivas para RT-PCR. De ellos, 391 fueron secuenciados y analizados mediante enfoques moleculares y evolutivos. Detectamos introducciones frecuentes de múltiples linajes de SARS-CoV-2 en el venado de cola blanca, que posteriormente se volvieron enzoóticos y cocircularon, y ciertos linajes persistieron en el venado de cola blanca incluso después de su disminución en las poblaciones humanas. Además, se identificaron tres casos de posible contagio del venado cola blanca a los humanos. Estos hallazgos sugieren que el venado de cola blanca podría servir como reservorio del SARS-CoV-2, presentando riesgos zoonóticos para los humanos. En el contexto de este manuscrito, el término "venado" se refiere específicamente al venado de cola blanca.

Desde el 4 de noviembre de 2021 hasta el 4 de abril de 2022, se recolectaron un total de 8830 muestras orales o nasales de venado cola blanca de Washington, DC y 26 estados de EE. UU. que participaron en este estudio. El SARS-CoV-2 se detectó en 944 muestras mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) (Fig. 1a). Secuenciamos genomas virales de 391 muestras con ARN de alta calidad. Entre estas secuencias, en este estudio se utilizaron 383 de 23 estados (Fig. 1b) con metadatos completos, y 346 de ellas tenían una cobertura genómica de> 50% (Datos complementarios 1). En general, 282 muestras tuvieron una alta cobertura de secuenciación (es decir, >95% del genoma de referencia) y fueron seleccionadas para análisis evolutivos adicionales.

una distribución temporal de muestras de hisopos nasales positivas para la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) del SARS-CoV-2 recolectadas en venados de cola blanca y aquellas seleccionadas para la secuenciación del genoma completo (WGS); b distribución geográfica de muestras de venado de cola blanca positivas para SARS-CoV-2 con WGS; c Variantes genéticas del SARS-COV-2 en muestras de hisopos nasales de venado cola blanca; d Variantes preocupantes (VOC) del SARS-CoV-2 circulantes en humanos en los Estados Unidos (enero de 2021 a octubre de 2022) y aquellas muestreadas en venados de cola blanca del 4 de noviembre de 2021 al 4 de abril de 2022. De 383 SARS- CoV-2 WGS con metadatos completos (Datos complementarios 1), 355 habían identificado linajes de Pango, incluida 1 variante sin VOC (B.1) y 354 VOC (70 Alpha, 9 Gamma, 273 Delta, 2 Omicron); Se utilizaron 282 WGS de alta calidad en análisis evolutivos y de transmisión. La flecha se utiliza para resaltar el número pequeño en una semana en particular. Tenga en cuenta que como d) se centra en la comparación de COV entre humanos y venados de cola blanca, el 1 de diciembre de 2021 se recopiló una única muestra de venado de cola blanca, que pertenece a una variante sin COV (B.1), en Pensilvania y no se mostró en el panel d. Los datos de origen para cada subpanel están disponibles en el archivo de datos de origen.

La asignación del linaje Pango identificó 34 linajes, que pertenecen a B.1 y cuatro VOC, Alpha (n = 70), Gamma (n = 9), Delta (n = 273) y Omicron (n = 2) (Datos complementarios 1) . Estos linajes de Pango se distribuyeron ampliamente en los estados muestreados (Fig. 1c). El noreste de EE. UU., incluidos Massachusetts (MA), Nueva York (NY), Nueva Jersey (NJ), Pensilvania (PA) y Virginia Occidental (WV), tuvieron el mayor número de linajes de Pango. Las variantes Alfa y Delta se detectaron en venados de cola blanca durante todo el período de muestreo, mientras que Gamma solo se detectó al principio del período de muestreo (es decir, del 20 de noviembre al 2 de diciembre de 2021) y Omicron solo hacia el final de nuestro período de muestreo (es decir, del 20 de noviembre al 2 de diciembre de 2021). , 24 de enero al 11 de febrero de 2022) (Fig. 1d). Durante todo el período de muestreo, Delta y Omicron fueron predominantes en humanos, pero Alfa y Gamma se informaron con poca frecuencia.

En conjunto, sublinajes genéticamente diversos del SARS-CoV-2 de Alfa, Gamma, Delta y Omicron circulaban conjuntamente en las poblaciones de venados de cola blanca en múltiples regiones geográficas de EE. UU. Alfa y Gamma circularon en las poblaciones de venados de cola blanca de EE. UU. durante todo el período del estudio, aunque ambas variantes se habían vuelto raras en humanos y fueron desplazadas por nuevas variantes (Delta y luego Omicron).

El número de probables eventos de contagio independientes de humanos a venados de cola blanca se determinó identificando un posible virus precursor en humanos para cada secuencia de SARS-CoV-2 de venados de cola blanca. Identificamos un virus precursor potencial de las bases de datos GenBank de GISAID (la Iniciativa global para compartir todos los datos sobre la influenza) y NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica) con los genomas de SARS-CoV-2 más similares que se recolectaron en el mismo estado antes de los ciervos. coleccion de muestra. Estos posibles virus precursores se integraron con las secuencias del venado cola blanca SARS-CoV-2 en árboles filogenéticos (Datos complementarios 10) y se realizaron análisis filogenéticos bayesianos (Fig. 2a y Datos complementarios 11). Los eventos de desbordamiento se determinaron y agruparon en tres categorías: Humano-Venado (al menos una secuencia humana precursora y una única secuencia de venado de cola blanca), Humano-Venado-Venado (al menos una secuencia humana precursora y al menos dos secuencias de venado de cola blanca). secuencias de venado de múltiples animales individuales), y Humano-Ciervo-Humano (al menos una secuencia humana precursora, al menos dos secuencias de venado de cola blanca de múltiples animales individuales y otra secuencia humana recopilada después de las secuencias de venado de cola blanca) (Ver Métodos).

a El árbol de credibilidad de clado máximo para las secuencias del SARS-CoV-2 del venado cola blanca (n = 282) y sus posibles virus precursores en humanos infirió 109 eventos de contagio independientes del SARS-CoV-2 de los humanos (directa o indirectamente) a los blancos. venado de cola (Datos complementarios 2 y Datos complementarios 11). Se identificaron tres tipos de eventos de desbordamiento: Humano-Venado (verde), donde cada evento consta de al menos una secuencia precursora humana y una secuencia de SARS-CoV-2 de venado cola blanca; Humano-Venado-Venado (azul), donde cada evento consta de al menos una secuencia precursora humana y al menos dos secuencias de venado cola blanca SARS-CoV-2; Humano-Venado-Humano (rojo) donde cada evento consta de al menos una secuencia precursora humana, al menos dos secuencias de venado de cola blanca y una secuencia humana adicional de SARS-CoV-2. La escala de tiempo del árbol filogenético se representó en unidades de años y la barra de escala indica el tiempo de divergencia en años. b El número de eventos de desbordamiento por variante de preocupación. c Distribución geográfica de los eventos Humano-Ciervo, d Humano-Ciervo-Ciervo y e Humano-Ciervo-Humano. Los datos de origen para el subpanel b-e están disponibles en el archivo de datos de origen.

De los 282 virus del venado de cola blanca analizados, se encontró que 238 estaban agrupados en 109 grupos que también contenían virus humanos SARS-CoV-2. Para cada grupo, se identificó una secuencia genómica del SARS-CoV-2 de un ser humano como el virus precursor con al menos un 99,85 % de identidad de nucleótidos, lo que indica al menos un evento de contagio independiente de los humanos al venado de cola blanca (Fig. 2a, Datos complementarios). 11 y datos complementarios 2). En total, se identificaron 109 eventos de contagio independientes, de los cuales 106 involucraron un virus precursor del SARS-CoV-2 humano dentro del mismo estado y los tres restantes involucraron un virus precursor del SARS-CoV-2 humano que se originó fuera del estado.

De estos 106 eventos de contagio dentro del estado, 64 fueron Humano-Ciervo (60 Delta, tres Alfa y un Omicron), 39 fueron Humano-Ciervo-Ciervo (29 Delta, ocho Alfa y dos Gamma) y 3 fueron Humano-Ciervo. Eventos Deer-Human (todos Delta) y se distribuyeron ampliamente en los estados muestreados (Fig. 2a, b). Los virus de Nueva York y Nueva Jersey tuvieron la mayor cantidad de eventos de contagio entre humanos, ciervos y ciervos (Fig. 2d). Nueve de 39 eventos de desbordamiento entre humanos, ciervos y ciervos contenían al menos cinco secuencias, y el más grande comprendía 17 secuencias. Las secuencias de venado de cola blanca dentro de cada evento de desbordamiento Humano-Venado-Venado o Humano-Venado-Humano tenían al menos un 99,85% de identidades de secuencia. Es de interés que las secuencias de venados de cola blanca agrupadas dentro de cada evento de desbordamiento Humano-Venado-Venado se tomaron muestras del mismo condado o de condados vecinos (Figura 1 complementaria); Es de destacar que todas las muestras en cada evento de desbordamiento se recolectaron en un plazo de tres semanas. Los tres eventos de desbordamiento Humano-Venado-Humano incluyeron 11, seis y dos secuencias de venado de cola blanca cada uno, y todas las secuencias de venado de cola blanca en cada evento de desbordamiento fueron tomadas del mismo condado o de condados vecinos.

Los otros tres eventos indirectos (Evento #107-109 en Datos complementarios 2) involucraron secuencias de SARS-CoV-2 humano de fuera del estado. De estos, todos fueron eventos Humano-Venado y pertenecían a la variante Delta, que involucraba VA (humano)-PA (Venado) (AY.25.1), OH (humano)-LA (Venado) (AY.119), VA (humano)- )-WV (Ciervo) (AY.119), respectivamente (Datos complementarios 11). Para nuestros análisis posteriores, nos centramos únicamente en los 106 eventos indirectos que involucraron secuencias de SARS-CoV-2 humano dentro del estado.

En general, estos resultados sugirieron que los virus del SARS-CoV-2 en el venado de cola blanca se originaron a partir de al menos 109 eventos de contagio directos o indirectos independientes de los humanos, de los cuales 106 involucraron secuencias de SARS-CoV-2 humano dentro del estado y tres involucraron secuencias de fuera del estado. Secuencias humanas de SARS-CoV-2. Estos efectos indirectos se detectaron en varios estados e involucraron múltiples linajes genéticos, incluidas las variantes Alfa, Gamma, Delta y Omicron.

Para dilucidar los patrones evolutivos del SARS-CoV-2 después de la introducción al venado de cola blanca, determinamos las sustituciones de aminoácidos comparando las secuencias del venado de cola blanca en el mismo grupo de desbordamiento con el posible precursor humano. Se identificaron un total de 833 sustituciones de aminoácidos al menos una vez en los 106 eventos de desbordamiento descritos anteriormente. De estas sustituciones, definimos las sustituciones adaptativas repetidas de aminoácidos como aquellas observadas en al menos dos eventos de desbordamiento y que no ocurren en todos los virus humanos previamente recolectados del mismo estado en bases de datos públicas (Métodos). Se observaron un total de 112 sustituciones repetidas de aminoácidos en múltiples proteínas virales, pero predominantemente en las proteínas ORF1a, ORF1b y S. Se observó selección positiva en 58 de estas sustituciones repetidas, mientras que se observó selección negativa en solo una de ellas (Fig. 3a y Datos complementarios 3). Estas 58 sustituciones de selección positiva se detectaron en múltiples linajes en el mismo VOC y en diferentes VOC, y tres de ellas se observaron en más de 10 eventos de desbordamiento.

un número de sustituciones repetidas de aminoácidos en las proteínas del SARS-CoV-2; b sustituciones repetidas de aminoácidos bajo selección positiva y su asociación con los eventos de transmisión independientes que se muestran en la Fig. 2. Cada fila representa un evento de transmisión y un cuadro rojo en cada columna representa una sustitución adaptativa observada en un evento específico (fila). Los datos complementarios 2 y los datos complementarios 11 contienen una lista de los eventos de desbordamiento. Para obtener información adicional sobre sustituciones de aminoácidos, consulte los Datos complementarios 3. Los datos de origen para cada subpanel están disponibles en el archivo de datos de origen.

De estas sustituciones repetidas, 27 se observaron en la proteína no estructural (NSP) 3, que es la proteína más grande del SARS-CoV-2 y está involucrada en la replicación viral como parte del complejo NSP3-4-6; este complejo también funciona en la modificación del retículo endoplasmático y en la formación de vesículas de doble membrana. Dominio de proteasa tipo papaína21, 22. Estas sustituciones se distribuyeron principalmente en Ubl1, dominio ácido y Mac1, que están relacionados con la unión del ARN monocatenario y la interacción con la proteína de la nucleocápside (N) y la unión de ADP-ribosa o poli (ADP-ribosa) 21 (Fig. 4a). Se observaron múltiples sustituciones repetidas en NSP7, NSP8 y NSP12, que forman un complejo de ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) que cataliza la síntesis de ARN23 viral; la mayoría de estas sustituciones se ubicaron fuera de la estructura RdRp, incluida una en el dominio de la nucleotidiltransferasa (NiRAN), pero no se observó ninguna en sitios enzimáticos o cerca de ellos (p. ej., dedos, palma y pulgar de NSP12) 25 (Fig. 4b). Además, se observaron 18 sustituciones repetidas en la proteína Spike, ocho en el dominio N-terminal, una en los subdominios 1 y 2, y una en el dominio de secuencia repetida de heptapéptidos (HR2) (Fig. 4c). Sorprendentemente, no se observaron sustituciones repetidas en el dominio RBD de Spike.

a Proteinasa similar a la papaína (proteína no estructural 3 [NSP3]; plantilla con el número de acceso del Protein Data Bank [PDB] n.° 6wuu), b ARN polimerasa dependiente de ARN (NSP7, NSP8 y NSP12; plantilla con PDB n.° 6m71), y proteína de pico c (plantilla con PDB #6vxx). Las estructuras fueron visualizadas por PyMOL. Las sustituciones adicionales se enumeran en Datos complementarios 3. Los datos de origen para la figura de barra en el subpanel a están disponibles en el archivo de datos de origen.

En resumen, el SARS-CoV-2 se adaptó rápida y repetidamente al venado de cola blanca con sustituciones de aminoácidos recurrentes y seleccionadas positivamente en la proteína Spike (aunque no en el RBD), la replicasa y otras proteínas.

Para evaluar más a fondo si el SARS-CoV-2 se está propagando entre los venados de cola blanca y se ha vuelto enzoótico en los venados de cola blanca, también evaluamos la seroprevalencia en el estado de Nueva York (NY), un estado con uno de los mayores números de infecciones nasales. /hisopos orales y muestras de suero disponibles, así como positividad consistente y persistente de SARS-CoV-2 en la detección qRT-PCR. En total, tomamos muestras de hisopos nasales/orales y/o muestras de suero de 987 animales individuales en 38 condados. De ellos, 790 animales tenían muestras pareadas de hisopo y suero, 68 solo tenían hisopos y 129 solo tenían muestras de suero (Datos complementarios 4).

Los resultados del cribado qRT-PCR mostraron que 184 animales (21,45%) dieron positivo para SARS-CoV-2, con muestras positivas de la mitad de los 38 condados muestreados (Fig. 5a). Para los seis condados con \(\ge\)50 animales, la positividad de qRT-PCR a nivel de condado osciló entre 8,70 y 62,50 %. En comparación, los resultados de la prueba de neutralización del virus sustituto (sVNT) mostraron que 332 animales (36,12%) fueron seropositivos para el SARS-CoV-2, abarcando 22 condados muestreados (Fig. 5a). Para cinco condados con \(\ge\)50 animales, la tasa de seropositividad a nivel de condado osciló entre 5,26% y 55,77%. La mayor prevalencia antigénica del virus en los hisopos nasales en comparación con la seroprevalencia sugirió brotes activos en venados de cola blanca durante el período de muestreo.

una tasa positiva específica del condado mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) o prueba de neutralización de virus sustituto (sVNT) en Nueva York, y solo se incluyeron aquellos condados con al menos cuatro muestras; b el árbol de credibilidad de clado máximo de los virus SARS-CoV-2 del venado cola blanca en Nueva York con seis eventos de transmisión con al menos cuatro secuencias de venado detectadas; c eventos de transmisión de virus SARS-CoV-2 en Nueva York analizados mediante el método de selección de variables de búsqueda estocástica bayesiana; d los árboles de credibilidad de clado máximo de los virus SARS-CoV-2 del venado cola blanca asociados con eventos de transmisión entre condados (caso 1-4, en naranja) y dentro del condado (caso 5-6 en rosa) detectados mediante el uso análisis filogeográficos. Los factores Bayes para estos eventos de transmisión en todo el condado se enumeran en los Datos complementarios 5. Los nodos en rojo eran secuencias de SARS-CoV-2 de venados de cola blanca y los en cian de humanos. Los datos de origen para el panel a están disponibles en Datos complementarios 4 y en el archivo de datos de origen.

Entre 790 animales con hisopos nasales/orales emparejados y muestras de suero de Nueva York, 101 dieron positivo para SARS-CoV-2 mediante ensayos qRT-PCR y sVNT, 60 solo mediante qRT-PCR y 168 solo mediante sVNT. Se consideró que un animal había estado expuesto al SARS-CoV-2 cuando la prueba fue positiva mediante qRT-PCR o sVNT, lo que resultó en 415 de 987 (42,05%) animales únicos tomados de muestras de Nueva York que estuvieron expuestos al SARS-CoV-2. 2.

Para comprender los patrones de transmisión entre venados de cola blanca en libertad, realizamos análisis de selección de variables de búsqueda estocástica bayesiana (BSSVS) de los virus de Nueva York de seis grupos genéticos, cada uno de los cuales involucró al menos cuatro infecciones por venados de cola blanca (Fig. 5c ). Los resultados mostraron que los virus en cuatro grupos se propagaron a través de condados vecinos y los de dos grupos se limitaron al mismo condado (Datos complementarios 5).

En conjunto, nuestros resultados mostraron que los virus SARS-CoV-2 eran enzoóticos en poblaciones de venados de cola blanca en libertad con transmisión activa entre poblaciones a niveles locales.

Nuestro análisis filogenético identificó tres grupos con posibles eventos de transmisión zoonótica secundaria, dos en Carolina del Norte y uno en MA (Fig. 2a, grupos Humano-Ciervo-Humano). Realizamos análisis adicionales, que mostraron que la secuencia de nucleótidos de un SARS-CoV-2 de un caso humano en Carolina del Norte era 99,93% idéntica a los virus del venado de cola blanca en Carolina del Norte (Figs. 6a y 7), otro SARS-CoV -2 de un caso humano en Carolina del Norte fue 99,94 % idéntico a los virus del venado de cola blanca en Carolina del Norte (Fig. 8). Las dos secuencias de SARS-CoV-2 de dos casos humanos en MA eran 99,96 % idénticas a las del venado de cola blanca en MA (Fig. 9).

a En un recuadro se encuentra el árbol de credibilidad de clado máximo que ilustra la relación genética entre las secuencias del SARS-CoV-2 del venado de cola blanca y las de los humanos, y el virus humano potencialmente originado en el venado de cola blanca; La presencia de sustituciones de aminoácidos repetidamente adaptativas específicas del venado de cola blanca se marcó en rojo para cada nodo del árbol. Los nodos en rojo eran secuencias de SARS-CoV-2 de venados de cola blanca, los de verde de humanos y los de azul de leones de zoológico. La escala de tiempo del árbol filogenético se representó en unidades de años y la barra de escala indica el tiempo de divergencia en años. b frecuencia de las dos sustituciones adaptativas repetidas específicas del venado de cola blanca en las secuencias del venado de cola blanca o del SARS-CoV-2 humano en bases de datos públicas. Marco de lectura abierto ORF, proteína S Spike y proteína no estructural NSP. Los datos de origen para el subpanel b están disponibles en el archivo de datos de origen.

a En un recuadro se muestra el árbol de máxima credibilidad del clado que ilustra la relación genética entre las secuencias del SARS-CoV-2 del venado de cola blanca y las de humanos, y la secuencia humana del SARS-CoV-2 potencialmente originada en el venado de cola blanca; la diversidad genómica (en comparación con Wuhan-Hu-1/2019) y la presencia de dos sustituciones repetidas de aminoácidos específicas del venado cola blanca, así como una sustitución de aminoácidos específica del evento (dividida por la línea azul), se marcaron en rojo para cada nodo en el árbol. La escala de tiempo del árbol filogenético se representó en unidades de años y la barra de escala indica el tiempo de divergencia en años. b frecuencia de las tres sustituciones específicas del venado de cola blanca en las secuencias del venado de cola blanca o del SARS-CoV-2 humano. Los nodos en rojo eran secuencias de SARS-CoV-2 de venados de cola blanca, los de verde de humanos y los de azul de leones de zoológico. Analizamos las variaciones de un solo nucleótido (iSNV) entre huéspedes en las 12 secuencias de venado de cola blanca y definimos un iSNV menor con al menos un 5% pero menos del 50% de prevalencia entre las lecturas. Entre estas 12 muestras, identificamos un único iSNV en 22-002350-031_NC_Randolph_2021-11-20_AY.103, que era ORF1b:V12271L con 461 lecturas que codifican el aminoácido L (39,6%) y 703 lecturas que codifican V (60,4%). en esta posición. Los datos de origen para el subpanel b están disponibles en el archivo de datos de origen.

En un recuadro se encuentra el árbol de credibilidad de clado máximo que ilustra la relación genética entre las secuencias del SARS-CoV-2 del venado de cola blanca y las de los humanos, y el virus humano potencialmente originado en el venado de cola blanca; la diversidad genómica (en comparación con Wuhan-Hu-1/2019) y la presencia de 3 sustituciones repetidas de aminoácidos específicas del venado de cola blanca (la estrella marca la que está bajo selección positiva) se marcaron en rojo para cada nodo del árbol. Ningún virus humano SARS-CoV-2 (excepto el que figura en el cuadro) de las bases de datos públicas contiene la combinación de estas tres sustituciones repetidas de aminoácidos específicas del venado cola blanca. Los nodos en rojo eran secuencias de SARS-CoV-2 de venado de cola blanca y los de cian, de humanos. La escala de tiempo del árbol filogenético se representó en unidades de años y la barra de escala indica el tiempo de divergencia en años.

Se identificaron tres polimorfismos específicos del venado de cola blanca en los virus humanos SARS-CoV-2 en el cuadro. Ningún virus humano SARS-CoV-2 (excepto el que figura en el cuadro) de las bases de datos públicas contiene la combinación de estos tres polimorfismos. La frecuencia de cada uno de los tres polimorfismos individuales en otros virus humanos SARS-CoV-2 se enumera en los Datos complementarios 7. Los nodos en rojo eran secuencias de SARS-CoV-2 de venado de cola blanca y los de cian, de humanos. La escala de tiempo del árbol filogenético se representó en unidades de años y la barra de escala indica el tiempo de divergencia en años.

Para evaluar si se trataba de posibles eventos de reflujo, identificamos secuencias adaptadas al venado de cola blanca utilizando las sustituciones repetidas de aminoácidos antes mencionadas (Fig. 3) y evaluamos más a fondo si las sustituciones adquiridas por el venado de cola blanca pueden haberse extendido a los humanos. Se observaron catorce sustituciones repetidas de aminoácidos en secuencias de venado de cola blanca de un grupo filogenético NC AY.103 Humano-Venado-Humano (Evento n.º 24 en Datos complementarios 2). Entre ellos, se observaron dos sustituciones adaptativas positivas de venado de cola blanca, S:S680F y ORF1a:T2283I (en la proteína NSP3), en una única secuencia humana de SARS-CoV-2 (número de acceso de GSAID: EPI_ISL_9246286, nombre del virus: NC-CORVASEQ -1086-651) (Figura 6a). Las frecuencias de cada una de las dos sustituciones fueron insignificantes en otras secuencias de SARS-CoV-2 humano, pero altas en secuencias de venado de cola blanca (Fig. 6b). Se observaron otras tres sustituciones específicas de venado de cola blanca (es decir, ORF1a:S443P [NSP2], ORF1b:V1271L [NSP 13] y ORF1a:T1678A [NSP 3]) en la secuencia NC-CORVASEQ-1086-651 humana, pero con poca frecuencia en secuencias humanas AY.103 (Fig. 7 y Datos complementarios 6). Ningún otro virus humano SARS-CoV-2 de bases de datos públicas contiene la combinación de estas cinco sustituciones específicas del venado cola blanca (Datos complementarios 6).

Las secuencias de humanos y venados de cola blanca en el evento NC AY.44 Humano-Venado-Humano (Evento #40 en Datos suplementarios 2) tuvieron una combinación de tres sustituciones repetidas específicas de venados de cola blanca (S:D936H, ORF8:K68E , y N:T379I), que no se detectaron en ninguna otra secuencia humana en bases de datos públicas (Fig. 8). De manera similar, las secuencias humana y de venado de cola blanca en el evento MA AY.119 Humano-Venado-Humano (Evento #65 en Datos complementarios 2) tenían una combinación de tres SNP (es decir, C7303T, C21459T y C26469T), que eran no identificado en ninguna otra secuencia humana de SARS-CoV-2 en bases de datos públicas (Fig. 9 y Datos complementarios 7).

Para determinar si alguna de las sustituciones repetidas de aminoácidos específicas del venado de cola blanca podría estar presente como variaciones de un solo nucleótido (iSNV) dentro del huésped en los virus humanos SARS-CoV-2, analizamos los iSNV minoritarios en 148 SARS-CoV humanos. -2 virus que secuenciamos de Missouri, pertenecientes a los mismos linajes AY.103, AY.119 y AY.44 que nuestros eventos Humano-Ciervo-humano (Datos complementarios 8). Se definió un iSNV minoritario cuando la frecuencia de un alelo era al menos del 5 % pero menos del 50 % entre las lecturas. Confirmamos la ausencia de SNV en los sitios donde detectamos sustituciones repetidas de aminoácidos específicas de venado de cola blanca en los eventos Humano-Venado-humano.

En resumen, nuestros análisis sugirieron tres posibles casos de contagio de los virus SARS-CoV-2 del venado de cola blanca a los humanos, con sustituciones de aminoácidos o SNP específicos del venado de cola blanca propagados a los humanos.

En este estudio, demostramos que el SARS-CoV-2 se ha detectado como enzoótico en venados de cola blanca en libertad en casi la mitad de los estados de EE. UU. Se identificaron virus secuenciados de los linajes Alfa, Gamma, Delta y Omicron (Fig. 1c), aunque solo Delta y Omicron circularon predominantemente en la población humana durante este período de muestreo. Los linajes del SARS-CoV-2 todavía estaban presentes en el venado de cola blanca, meses después de la disminución de esos linajes en la población humana (Fig. 1d). Estos resultados fueron consistentes con un informe anterior, que mostró que dos venados de cola blanca fueron infectados con la variante Alfa a mediados de noviembre, seis a siete meses después de la ola Alfa en humanos18. En otro estudio, Caserta et al. detectó los virus Alfa y Gamma en el venado de cola blanca de Nueva York entre octubre y diciembre de 2021 después de que estos VOC fueron reemplazados por Delta y Omicron en humanos, y detectó virus Delta en el venado de cola blanca de Nueva York entre octubre y noviembre de 2021 durante el período en que Delta y Omicron fueron predominantes en humanos19. Además, los linajes identificados en este estudio también incluyeron aquellos que surgieron en los EE. UU. a finales de 2021 o 2022, superponiéndose a nuestro período de muestreo. En general, este estudio demostró que continuaban ocurriendo introducciones frecuentes de nuevos virus humanos en venados de cola blanca en libertad, y que los COV del SARS-CoV-2 eran capaces de persistir en venados de cola blanca incluso después de que esas variantes se volvieran raras en el ser humano. población.

Nuestros análisis sugirieron que los virus del venado de cola blanca tenían identidades genéticas altas en comparación con los de los humanos, y hubo al menos 109 eventos de contagio independientes de humanos a venados de cola blanca (Fig. 2a). Dada la gran abundancia de venados de cola blanca en los EE. UU. y su distribución en entornos rurales, suburbanos y urbanos, las interacciones directas e indirectas entre humanos y venados de cola blanca son frecuentes. Por ejemplo, la alimentación suplementaria del venado de cola blanca ha sido una fuente común de interacciones entre humanos y venados de cola blanca y se ha documentado que facilita la transmisión de la tuberculosis bovina en venados de cola blanca en libertad en Michigan26. Con introducciones muy frecuentes de SARS-CoV-2 humano en venados de cola blanca, las rutas de transmisión tanto directa como indirecta siguen siendo plausibles. Se necesitan más estudios para caracterizar e identificar interacciones que tienen el potencial de conducir a la transmisión entre humanos y venados de cola blanca. La introducción viral en el venado de cola blanca podría resultar de exposiciones a ambientes contaminados y fómites (p. ej., desechos de alimentos humanos, máscaras y otros productos de desecho contaminados) o mediante interacciones directas con otros huéspedes animales. El venado de cola blanca tiene interacciones directas e indirectas con muchas otras especies animales (p. ej., zorro rojo, zorrillos y otros roedores), que son susceptibles a la infección por SARS-CoV-227,28,29,30.

Desde su aparición, el SARS-CoV-2 ha evolucionado rápidamente en las poblaciones humanas. El virus ha adquirido una serie de sustituciones de aminoácidos en Spike y otras proteínas. De estas sustituciones, algunas importantes han involucrado el dominio Spike RBD y dieron como resultado virus con una mayor unión del receptor a los receptores ACE2 humanos31 y una capacidad mejorada para evadir los anticuerpos neutralizantes32. Además, también se han observado sustituciones en otras proteínas como la nucleoproteína (p. ej., NP:R203K/G204R), que pueden aumentar la carga positiva local para aumentar la unión al ARN y la eficiencia del ensamblaje de RNP debido a los aminoácidos básicos adicionales33. En este estudio, identificamos 112 sustituciones de aminoácidos recurrentes en los virus del venado de cola blanca, y 58 de ellas estaban bajo selección positiva, lo que sugiere que los virus se estaban adaptando al venado de cola blanca. Sin embargo, no se observaron sustituciones ni en el RBD ni en los sitios enzimáticos de la polimerasa, lo que indica que el RBD y la polimerasa probablemente ya eran aptos para el venado de cola blanca. Es necesario investigar más a fondo el papel de estas sustituciones recurrentes en la adaptación del venado cola blanca.

Exploramos más a fondo si las 58 sustituciones adaptativas del venado de cola blanca estaban situadas en regiones inmunogénicas del SARS-CoV-2 y si se superponían con alguna sustituciones identificadas en otros animales o humanos. Como nuestra comprensión de los epítopos de células T y de células B específicas del venado de cola blanca es actualmente limitada, investigamos si las sustituciones adaptativas del venado de cola blanca estaban ubicadas dentro de los epítopos de células T y de células B específicas de humanos del SARS- CoV-2, que han sido seleccionados en Immune Epitope Database (https://www.iedb.org). Nuestro análisis reveló que 51 de las 58 sustituciones adaptativas de venado de cola blanca estaban situadas en epítopos de células T humanas (n = 9) o de células B (n = 42) del SARS-CoV-2 (Datos complementarios 9) . El contagio de estas cepas adaptadas al venado de cola blanca a los humanos tiene el potencial de socavar la eficacia de la inmunidad preexistente asociada con estos epítopos generados a partir de infecciones y/o vacunas previas por SARS-CoV-2 dentro de la población humana. Sin embargo, se necesitan más investigaciones para comprender la relación entre la importancia adaptativa de estas sustituciones y la inmunidad colectiva del venado cola blanca.

A diferencia del venado de cola blanca, un estudio con visones informó cuatro sustituciones (L452M, Y453F, F486L, N501T) en la proteína de pico durante un brote de SARS-CoV-2 en una granja holandesa34, y tres de esos sitios (Y453F, F486L , N501T) se observaron repetidamente en brotes de visones35. Bashor, et al.36 identificaron 7 SNV (H69R, D215H, D215N, N501T, D614G, H655Y y S686G en Spike, y L37F en ORF1a) que se han reportado como variantes preocupantes en humanos u otras especies como gatos, perros , hámsteres y hurones. Se observaron mutaciones adaptativas en estas variantes en múltiples huéspedes. Sin embargo, estos sitios no estaban entre los que identificamos en el venado de cola blanca. Además, comparamos los sitios de selección positiva en venados de cola blanca con los reportados en humanos37,38,39, y encontramos que ninguno se superponía. Por lo tanto, las sustituciones adaptativas que identificamos en este estudio probablemente fueron específicas del venado de cola blanca y pueden haber surgido dentro de la población de venados como resultado de la presión selectiva sobre el virus.

Al integrar datos serológicos y moleculares, demostramos que aproximadamente el 42 % de los venados de cola blanca en Nueva York habían estado expuestos al SARS-CoV-2 (Fig. 5a; Datos complementarios 4). Los eventos de transmisión se identificaron dentro y entre los condados a partir de análisis filogeográficos (Fig. 5b, c), lo que sugiere fuertemente que se produjo una transmisión activa entre los venados de cola blanca. Es interesante destacar que 101 venados de cola blanca fueron seropositivos en las pruebas qRT-PCR y sVNT, como se observó durante las últimas etapas de la infección en estudios experimentales de infección con venados de cola blanca13, 14. En esos estudios, se demostró que los venados de cola blanca se vuelven no infecciosos una vez que los títulos de anticuerpos neutralizantes fueron detectables.

La transmisión eficiente de venado a venado podría facilitar el establecimiento del venado de cola blanca como reservorio del SARS-CoV-2, presentando riesgos continuos de transmisión zoonótica a personas y otros animales. Los linajes con mutaciones adaptativas del venado de cola blanca pueden aumentar aún más el riesgo para los humanos. Además, la transmisión de virus SARS-CoV-2 más antiguos del venado de cola blanca a personas que ahora son poco comunes en la población humana puede representar un riesgo mayor a medida que disminuye la inmunidad a estos linajes40, 41. Nuestros hallazgos resaltan las posibles implicaciones para la salud pública de transmisión del venado de cola blanca a humanos, pero se necesitan más estudios con muestras más grandes para comprender completamente el alcance de la transmisión y los riesgos asociados para la salud humana.

Se han documentado eventos de transmisión zoonótica similares en los virus de la influenza A H3N2 estacional humana, que se transmitieron de los humanos a los cerdos en la década de 199042, facilitando la generación del virus pandémico de 2009 a través de reordenamientos genéticos con los virus de la influenza humana, aviar y porcina contemporáneos43. La variante porcina del virus H3N2 (H3N2v) siguió siendo antigénicamente más similar a los virus precursores del H3N2 humano en la década de 1990, pero no a los virus H3N2 estacionales contemporáneos en humanos44. Desde 2011, este virus H3N2v se ha transmitido frecuentemente a humanos y ha causado 439 infecciones confirmadas, particularmente en aquellos que nacieron después de 2000 y que aún no habían estado expuestos a este subtipo de virus45.

Recientemente, se informó un caso de zoonosis secundaria en Canadá que se asoció con un linaje muy distinto secuenciado del venado de cola blanca11. Para probar si hubo eventos de zoonosis secundaria entre nuestras muestras, comparamos exhaustivamente nuestras secuencias de SARS-CoV-2 de venado de cola blanca y todas las secuencias de SARS-CoV-2 humano en bases de datos públicas. Identificamos tres casos potenciales de zoonosis inversa en dos estados de EE. UU. Se llevó a cabo una investigación epidemiológica retrospectiva para determinar si las cinco personas asociadas con el evento AY.103 Humano-Ciervo-Humano en Carolina del Norte, que también incluyó tres secuencias de SARS-CoV-2 de leones del zoológico (Fig. 6a), tuvieron contacto con ciervos. en el mes anterior a la enfermedad asociada con COVID-19. Contactamos con éxito a tres individuos, pero ninguno informó contacto cercano ni con los ciervos ni con el zoológico. Sin embargo, los virus en los casos humanos de los tres eventos de transmisión de venados a humanos que detectamos tenían sustituciones de aminoácidos o SNP específicos del venado de cola blanca, que se observaron de manera insignificante en otros genomas humanos del SARS-CoV-2. La inferencia de zoonosis secundaria a partir de un árbol filogenético está limitada por los datos de secuencia disponibles. Actualmente es escasa la información sobre la frecuencia con la que los humanos infectados están en contacto con el venado de cola blanca o viceversa, y la probabilidad de que se produzca una transmisión entre especies en esas circunstancias. En general, estos posibles casos resaltan la posibilidad de transmisión bidireccional del SARS-CoV-2 en la interfaz entre el hombre y el venado de cola blanca.

Una limitación de este estudio es que los datos humanos del SARS-CoV-2 de las bases de datos públicas carecen de granularidad geográfica y pueden no cubrir las áreas donde se recolectaron nuestras muestras de venado cola blanca, aunque en nuestros análisis se incluyeron más de 14 millones de secuencias de genomas. Por ejemplo, entre 282 secuencias de SARS-CoV-2 de venado de cola blanca, hubo 18 en las que no pudimos identificar ninguna secuencia de SARS-CoV-2 humano genéticamente cercana dentro del mismo estado que el virus precursor potencial (Fig. 2a). Este estudio también tiene una limitación porque la cantidad de muestras recolectadas en el mismo sitio de muestreo fue limitada y generalmente duró menos de dos semanas. Esta duración limitada del muestreo nos impidió comprender completamente la duración y la dinámica poblacional de cada variante del SARS-CoV-2 en la población de venados de cola blanca. Se necesitan investigaciones adicionales que analicen los virus SARS-CoV-2 humanos y del venado de cola blanca recolectados durante un período prolongado en la misma área geográfica para dilucidar aún más los patrones de transmisión del SARS-CoV-2 en venados de cola blanca y entre personas y personas blancas. -ciervo de cola.

En resumen, este estudio muestra que el SARS-CoV-2 era enzoótico en los venados de cola blanca, y que los virus que circulan en los venados de cola blanca provienen de eventos de contagio frecuentes e independientes de humanos con múltiples linajes genéticos que cocirculan entre los venados de cola blanca. , incluidos los linajes observados en humanos antes y durante nuestro período de muestreo. Es necesaria una vigilancia continua a gran escala del venado de cola blanca para comprender la evolución y distribución de las variantes genéticas en el venado de cola blanca, evaluar si el venado de cola blanca es un reservorio potencial de los virus SARS-CoV-2 y el papel de Venado cola blanca en ecología e historia natural del SARS-CoV-2.

Los venados de cola blanca fueron capturados bajo un acuerdo de manejo de daños a la vida silvestre administrado por USDA/APHIS Wildlife Services. La recolección de muestras se realizó de manera oportunista en colaboración con agencias reguladoras y como parte de programas de vigilancia de rutina. El sexo y el género no fueron excluidos en este estudio. Este estudio se centra en la evolución y transmisión viral y no incluyó un análisis del género y sexo del huésped.

Para comparar las variaciones de un solo nucleótido intrahospedador entre los virus SARS-CoV-2 humanos y de venado de cola blanca, se seleccionaron muestras humanas no identificadas que dieron positivo para SARS-CoV-2 de una cohorte de muestras recolectadas de forma rutinaria en la Universidad. of Missouri Health Care, que cubre Columbia, MO y los condados vecinos, y este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Missouri (#2025449). El sexo y el género no fueron excluidos en este estudio. No se llevaron a cabo esfuerzos de reclutamiento específicos.

Desde el 4 de noviembre de 2021 hasta el 4 de abril de 2022, se recolectaron un total de 8830 muestras de hisopos nasales de venado cola blanca en Washington, DC y 26 estados participantes en los EE. UU., ya sea mediante recolección por parte de cazadores o por agencia. Ninguno de los animales muestreados mostró signos clínicos de infección por SARS-CoV-2. Más del 95% de la población de venados de cola blanca reside en el noreste, medio oeste y sureste de los Estados Unidos, representados por Washington, DC y 26 estados participantes en los EE. UU. de donde se recolectaron las muestras46. En estas regiones también es donde los cazadores cazan anualmente gran parte de los 6 millones de venados de cola blanca47. En la gran mayoría de los casos, se recogió una muestra de sangre pareada en una tira filtrante Nobuto para análisis serológico.

El ARN del SARS-CoV-2 se preparó a partir de muestras de hisopos orales y nasales conservadas en PrimeStore Molecular Transport Media (MTM, Longhorn Vaccines and Diagnostics LLC, n.º de catálogo LH105) utilizando los kits de purificación de ácidos nucleicos MagMAX™ CORE (Applied Biosystems, n.º de catálogo A32702) en de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. 5 µL de extracto de ARN fueron para la detección por qRT-PCR de los objetivos N1 y N2 del SARS-CoV-2 utilizando el kit BioRad Reliance One-Step Supermix (n.º de catálogo 12010221) con cebadores y sondas RUO del SARS-CoV-2 obtenidos de Integrated DNA Technologies. (número de catálogo 10006713). Las condiciones de reacción y termociclado fueron idénticas a las descritas para el ensayo de RT-PCR BioRad Reliance SARS-CoV-2, y los datos se adquirieron con el sistema de detección de PCR en tiempo real BioRad CFX96 Touch o el sistema de PCR en tiempo real CFX Opus.

Para la amplificación por RT-PCR del genoma completo del SARS-CoV-2, se prepararon bibliotecas de ADNc utilizando el kit de preparación de muestras de ADN Nextera XT (n.º de catálogo FC-131-1096) y la secuenciación se realizó con el kit de reactivos MiSeq v2 de 500 ciclos (n.º de catálogo). MS-102-2003) según las instrucciones del fabricante48. La calidad de las lecturas de extremos emparejados obtenidas de la secuenciación MiSeq se analizó y recortó con una puntuación de calidad Phred de 20, lo que indica una precisión de llamada de base del 99 %, la probabilidad de encontrar 1 llamada de base incorrecta entre 100 bases49. El ensamblaje de la secuencia y la construcción de la secuencia consenso se realizaron con Wuhan-Hu-1 (Número de acceso: NC_045512.2) como genoma de referencia mediante el uso del Metaensamblador de refinamiento iterativo (IRMA, v1.0.2)50. Se realizaron curación y validación manuales para aquellas posiciones genómicas con baja cobertura. Se utilizó IRMA para analizar variantes de un solo nucleótido (SNV) y evaluar la diversidad genómica viral dentro del huésped. Se identificó un iSNV minoritario cuando la frecuencia de un alelo era al menos del 5 % pero menos del 50 % entre las lecturas. Además, las secuencias de consenso se validaron utilizando Qiagen CLC Genomics Workbench 20.0.4 con una puntuación de calidad de 0,05.

NextStrain51 se utilizó para alinear las secuencias genómicas del SARS-CoV-2 y también para identificar las sustituciones de nucleótidos y aminoácidos entre las secuencias del SARS-CoV-2 del venado de cola blanca y la secuencia precursora humana asociada del SARS-CoV-2. Debido a la baja cobertura en la región 5' no traducida (antes de la posición 266) y la región 3' no traducida (después de la posición 29.674) del genoma, excluimos estas posiciones de los análisis de sustitución de nucleótidos y aminoácidos.

Se utilizó el software Phylogenetic Assignment of Named Global Outbreak Lineages (PANGOLIN) (v4.0.5)20 (PANGO v4.0.6 (2022-04-22)) para determinar los linajes de Pango para cada secuencia de venado de cola blanca. Se logró la clasificación del linaje genético para 355 secuencias. Entre estas muestras, solo se seleccionaron para análisis evolutivos adicionales aquellas con una alta cobertura de secuenciación superior al 95% del genoma de referencia (n = 282), una puntuación IRMA del 95%.

Los análisis bayesianos a escala de tiempo se realizaron utilizando el método Monte Carlo de la cadena de Markov (MCMC) con análisis filogenético bayesiano mediante el software de muestreo de árboles (BEAST)52 v.1.10.4. Cada árbol fue generado por un modelo de sustitución HKY con gamma = 4 y un crecimiento exponencial coalescente previo con reloj estricto. La longitud de la cadena MCMC se estableció entre 30 y 100 millones de iteraciones con un submuestreo cada 10.000 iteraciones. El paquete babette53 R v.2.3.2 se utilizó para el procesamiento BEAST por lotes. Se utilizó Tracer v1.7.2 para evaluar los resultados. El árbol de máxima credibilidad del clado (MCC) se resumió utilizando TreeAnnotator54 v.1.10.4, con una tasa de quemado del 20% y el tiempo estimado de divergencia representado por la altura mediana del nodo. Se utilizó el paquete ggtree55 R v3.8.0 para la visualización del árbol.

Para determinar si el SARS-CoV-2 se transmitió entre poblaciones de venados de cola blanca dentro de la misma área geográfica o en diferentes áreas geográficas, realizamos análisis filogeográficos bayesianos utilizando BEAST52 (v.1.10.4). El análisis de selección de variables de búsqueda estocástica bayesiana (BSSVS) se realizó con el condado como rasgos discretos para las secuencias del SARS-CoV-2 del venado de cola blanca. Los eventos de transmisión se filtraron para determinar su significación estadística utilizando los criterios del factor Bayes56 y probabilidad posterior >0,7, así como los condados geográficamente cercanos. Se definieron diferentes niveles de apoyo estadístico de la siguiente manera: 3 \(\le\) factor de Bayes \(\le\) 10 indica apoyo; 10 \(\le\) factor de Bayes \(\le\) 100 indica un fuerte apoyo; 100 \(\le\) factor de Bayes \(\le\) 1000 indica un soporte muy fuerte; y el factor de Bayes \(\ge\) 1000 indica un apoyo decisivo.

Para identificar el virus precursor potencial del virus SARS-CoV-2 del venado de cola blanca, agrupamos todos los genomas del SARS-CoV-2 de humanos y venados de cola blanca por estado y linajes de Pango. Como resultado, se obtuvieron 89 conjuntos de datos, cada uno de los cuales contenía secuencias de SARS-CoV-2 de humanos y venados de cola blanca del mismo estado y del mismo linaje Pango. Para garantizar la solidez de nuestra selección, se utilizaron dos métodos para seleccionar las secuencias más cercanas para cada secuencia de SARS-CoV-2 de venado de cola blanca: 1) se utilizó FastTree57 v1.4.4 para identificar esas secuencias según la topología; 2) Se utilizó el método Vector de composición completa (CCV) v1.058 para identificar aquellas secuencias basadas en distancias genéticas, y CCV es un método libre de alineación para permitir la medición de distancias genéticas a gran escala. Se identificaron las secuencias únicas de las 20 secuencias mejor clasificadas de cada método (Datos complementarios 10) y se utilizaron para análisis filogenéticos bayesianos. Para el procesamiento de datos de secuencias se utilizó el paquete Biopython v1.7959. Se utilizaron los siguientes criterios para determinar si un genoma humano del SARS-CoV-2 era un virus precursor para una prueba del genoma del SARS-CoV del venado de cola blanca: 1) los genomas deberán pertenecer al mismo grupo genético con una probabilidad posterior ≥0,70; 2) la identidad de nucleótidos será al menos del 99,85%. Para garantizar que nuestros análisis no descarten los virus SARS-CoV-2 que podrían provenir de los virus que circulan en los venados de cola blanca (por ejemplo, informados por estudios anteriores) y otros animales, realizamos análisis similares que incluyen virus de huéspedes no humanos. Los resultados mostraron que las secuencias del SARS-CoV-2 del venado cola blanca de este estudio son genéticamente diversas de las informadas anteriormente (Fig. 10). En total, identificamos un virus precursor humano para 264 de las 282 secuencias de SARS-CoV-2 de venado cola blanca analizadas, mientras que no se identificó ningún virus precursor humano del mismo estado para las 18 secuencias restantes.

Se descargaron un total de 332 genomas de SARS-CoV-2 de venado de cola blanca de GISAID (Iniciativa global para compartir todos los datos sobre la influenza) el 5 de diciembre de 2022. Entre estos genomas, 118 tenían secuencias completas y de alta cobertura (>99 % de cobertura). y se incluyeron en los análisis evolutivos junto con las muestras de venado cola blanca SARS-CoV-2 recolectadas en este estudio. La escala de tiempo del árbol filogenético se representó en unidades de años y la barra de escala indica el tiempo de divergencia en años.

Es posible que la transmisión ocurra entre el venado de cola blanca y los viajeros de fuera del estado, como por ejemplo a través de la caza o el contacto con animales. Para garantizar la inclusión de posibles eventos de transmisión fuera del estado, utilizamos la colocación de muestras ultrarrápidas en árboles existentes (UShER) en los 14,3 millones de datos genómicos públicos del SARS-CoV-2 al 30 de marzo de 2023. UShER implementa el algoritmo Fitch-Sankoff para inferir la ubicación de las mutaciones en un árbol determinado y en la lista de variantes y el árbol anotado por mutaciones60. Para 264 secuencias de venado de cola blanca con una secuencia humana coincidente del mismo estado en nuestros análisis anteriores, UShER identificó secuencias de virus genéticamente cercanas para 230 del mismo estado y 30 de secuencias humanas de fuera del estado. Para las 18 secuencias de venado de cola blanca sin ninguna secuencia humana coincidente del mismo estado en nuestros análisis anteriores, UShER identificó virus de secuencia genéticamente cercana para todos ellos.

El análisis filogenético de los eventos de desbordamiento se realizó utilizando una combinación de secuencias de SARS-CoV-2 humano fuera del estado obtenidas de UShER y secuencias humanas dentro del estado obtenidas de análisis FastTree y CCV. Las secuencias se seleccionaron según los siguientes criterios: (1) pertenecían a los mismos linajes de Pango que las secuencias de venado de cola blanca coincidentes; (2) fueron recolectados únicamente en los EE. UU.; y (3) su fecha de recolección fue anterior o igual a la fecha de recolección de las muestras de venado cola blanca.

Para identificar posibles eventos de contagio independientes del SARS-CoV-2 de los humanos y comprender la dinámica de transmisión de los virus del SARS-CoV-2 en las poblaciones de venados de cola blanca, se definieron tres tipos de grupos: humano-ciervo, humano-ciervo-ciervo. y Humano-Ciervo-Humano. Para todos estos grupos, se identificó al menos un virus precursor humano; aquellos sin virus precursor humano fueron excluidos de este análisis. Para 282 secuencias de SARS-CoV-2 de venado de cola blanca identificadas, pudimos asignar 238 de ellas a uno de estos tres grupos (Datos complementarios 2). Los siguientes criterios específicos se utilizan para cada grupo.

Humano-Venado: 1) el virus precursor humano y una única secuencia del SARS-CoV-2 del venado cola blanca; 2) todas las secuencias humanas y del SARS-CoV-2 eran del mismo estado y pertenecían al mismo linaje Pango; 3) la probabilidad posterior (PP) > 0,7 para la rama humano-ciervo; y 4) las identidades de secuencia de nucleótidos entre la secuencia precursora humana y la secuencia del SARS-CoV del venado cola blanca fue ≥99,85%.

Humano-Venado-Venado: 1) el virus precursor humano y al menos dos secuencias del SARS-CoV-2 del venado cola blanca; 2) todas las secuencias humanas y de SARS-CoV-2 eran del mismo estado y pertenecían al mismo linaje Pango (una sola secuencia de SARS-CoV-2 de venado de cola blanca de un estado interior diferente se eliminaría de este evento); 3) la probabilidad posterior (PP) > 0,7 para la rama humano-ciervo; y 4) las identidades de secuencia de nucleótidos entre la secuencia del SARS-CoV precursor humano y al menos una de las secuencias del SARS-CoV del venado de cola blanca ≥99,85%.

Humano-Venado-Humano: 1) el virus precursor humano, al menos dos secuencias de SARS-CoV de venado de cola blanca y otra secuencia de SARS-CoV-2 humano; 2) todas las secuencias humanas y del SARS-CoV-2 eran del mismo estado y pertenecían al mismo linaje Pango; 3) la secuencia humana2 y al menos una de las secuencias del SARS-CoV-2 del venado cola blanca formaron una subrama venado-humano2; 4) PP > 0,7 tanto para human1-la rama de venado como para la subrama deer-human2; 4) la identidad de la secuencia de nucleótidos entre human1 y al menos uno de los venados de cola blanca SARS-CoV-2, y la de human2 y al menos uno de los venados de cola blanca SARS-CoV-2 fue ≥99,85%.

La selección positiva ocurre cuando la tasa de sustituciones no sinónimas (β) es mayor que la tasa de sustituciones sinónimas (α), mientras que la selección negativa ocurre cuando β < α. Tanto los análisis de selección positiva como la negativa se realizaron utilizando FUBAR (Fast, Unconstrained Bayesian AppRoximation), del software HyPhy v2.5.42(MP)61, 62. Los árboles filogenéticos generados por FastTree de cada gen, se utilizaron en los análisis con el Secuencias de venado de cola blanca marcadas para probar la selección positiva o negativa en una rama específica del árbol filogenético. Consideramos que los sitios con una probabilidad posterior >0,9 eran significativos, lo que indica una selección positiva (prob(α < β)) o una selección negativa (prob(α > β))61.

Para comprender si las sustituciones de aminoácidos podrían ocurrir de forma independiente después de que el virus se introdujo en la población de venados de cola blanca, intentamos identificar esas sustituciones de aminoácidos repetidas en los grupos de Humano-Venado, Humano-Venado-Venado y Humano-Venado-. Humano. Se definió una sustitución repetida de aminoácidos con los siguientes criterios: 1) la sustitución se observó al menos dos veces en esos 106 grupos dentro del estado de Humano-Venado, Humano-Venado-Venado y Humano-Venado-Humano; 2) la sustitución no se mostró en todos los virus humanos SARS-CoV-2 del mismo linaje del mismo estado; 3) la sustitución tuvo una frecuencia baja (p. ej., <0,15 %, obtenida por el paquete Outbreak.info R v0.2.063) en todos los virus humanos SARS-CoV-2 de EE. UU. y de todo el mundo. Si una sustitución repetida de aminoácidos estaba bajo selección positiva, se definió como una sustitución adaptativa del venado de cola blanca.

Para mejorar la precisión y confiabilidad de nuestros análisis y mitigar los posibles problemas que surgen de posiciones genómicas específicas que son propensas a errores de secuenciación y recombinación, exploramos un enfoque de enmascaramiento para refinar nuestros análisis. Específicamente, enmascaramos 265 posiciones problemáticas según lo informado (fuente: https://github.com/WL/ProblematicSites_SARS-CoV2), seguidas de análisis filogenéticos. Las topologías de árbol resultantes derivadas del árbol del genoma completo (ver descripción anterior) y el árbol con las posiciones enmascaradas exhibieron una sorprendente similitud (Datos complementarios 12). Al excluir las posiciones informadas del árbol, realizamos un nuevo análisis de los eventos de transmisión y el número de eventos de transmisión se mantuvo sin cambios cuando utilizamos las mismas reglas de identificación. También realizamos una evaluación y determinamos que ninguna de las sustituciones adaptativas específicas del venado cola blanca se encontró dentro de las 265 posiciones problemáticas. Por lo tanto, parece que las posiciones enmascaradas no afectan significativamente los análisis realizados en este estudio. Por lo tanto, todos los análisis realizados en este estudio se realizaron sin aplicar máscara en las 265 posiciones mencionadas.

Las secuencias genómicas de la mayoría de los virus SARS-CoV-2 del venado cola blanca y sus correspondientes virus precursores potenciales del SARS-CoV-2 humano obtenidos de bases de datos públicas demostraron una alta identidad de secuencia de nucleótidos genómicos, superando el 99,80% (Figura complementaria 2a). ). Para evaluar la confiabilidad de los parámetros utilizados para definir los eventos de transmisión, es decir, la identidad de secuencia y la probabilidad posterior, realizamos análisis adicionales que abarcan varios rangos de parámetros. Ilustrados en las figuras complementarias 2b-e, nuestros hallazgos revelaron que el número de eventos de desbordamiento se mantuvo bastante constante cuando se utilizó un límite de identidad de secuencia del 99,85% o menos. Por ejemplo, detectamos un total de 110 eventos de desbordamiento con una identidad de secuencia del 99,80% o menos. Sin embargo, a medida que el límite de identidad de la secuencia se hizo más estricto, el número de grupos disminuyó notablemente debido a la falta de los correspondientes virus precursores humanos del SARS-CoV-2. Específicamente, identificamos 100 eventos de desbordamiento con una identidad de secuencia del 99,90% y solo 66 eventos con una identidad de secuencia del 99,95%. Por el contrario, la probabilidad posterior no tuvo un impacto notable en el número de eventos de transmisión, ya que los subclados de los árboles asociados con la mayoría de estos eventos exhibieron una probabilidad posterior de 0,90 o superior. Solo el subclado asociado con un evento de desbordamiento humano-Ciervo-humano tuvo una probabilidad posterior de 0,78 y otro con un evento de desbordamiento humano-Ciervo tuvo una probabilidad posterior de 0,66. Estos análisis de ajuste de parámetros confirman aún más la solidez de los criterios empleados en el análisis de eventos de transmisión. Específicamente, se han validado como umbrales confiables y efectivos un límite de identidad de secuencia del 99,85% y una probabilidad posterior de 0,70.

Los anticuerpos se extrajeron de tiras de papel de filtro Nobuto (Sterlitech, número de catálogo 49010010) y se examinaron en el Centro Nacional de Investigación de Vida Silvestre del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (Fort Collins, EE. UU.) en una dilución funcional de 1:20. Las muestras extraídas se examinaron mediante una prueba de neutralización de virus sustituto (sVNT, Genscript cPass™, n.º de catálogo L00847-A) y los datos se adquirieron mediante un lector de microplacas multimodo VarioSkan Flash o Varioskan LUX (Thermo Fisher)16. Se utilizaron al menos dos réplicas técnicas para el cálculo del % de inhibición promedio. El sVNT no ha sido validado para ciervos; sin embargo, evaluaciones anteriores con muestras de suero de venado cola blanca sugirieron que los resultados de la sVNT eran cualitativamente similares a una prueba de neutralización del virus SARS-CoV-2 altamente específica16.

Se descargaron plantillas estructurales de diferentes funciones con genes del SARS-COV-2 del Protein Data Bank (PDB)64. Las secuencias de venado de cola blanca se alinearon con las secuencias plantilla mediante MUSCLE v5.165. La visualización se realizó mediante PyMOL v2.5.466.

Todas las secuencias genómicas del SARS-CoV-2 disponibles (n = 11,778,398 para el 9 de julio de 2022) de humanos se descargaron de GISAID, y los genomas adicionales (n = 1,020,486 para el 7 de abril de 2022) se seleccionaron de GenBank. A partir de estas secuencias, se seleccionaron secuencias humanas del SARS-CoV de los 23 estados donde tomamos muestras de las secuencias del venado de cola blanca. Después de eliminar las entradas redundantes y seleccionar las secuencias completas y de alta cobertura, se obtuvieron para este estudio un total de 717.717 secuencias genómicas del SARS-CoV-2. Además, el 5 de diciembre de 2022, descargamos un total de 332 genomas de SARS-CoV-2 de venado cola blanca de GISAID. Entre estos genomas, 118 tenían secuencias completas y de alta cobertura (>99% de cobertura) y se incluyeron en los análisis evolutivos junto con las muestras de venado cola blanca SARS-CoV-2 recolectadas en este estudio. Todas estas secuencias disponibles públicamente y los metadatos asociados utilizados en este conjunto de datos se publican en la base de datos EpiCoV de GISAID y en los recursos NCBI SARS-CoV-2.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos genómicos de todos los virus SARS-CoV-2 generados en este estudio se enviaron a GISAID y NCBI GenBank. Los datos complementarios 1 contienen los números de acceso de GISAID y Bioproject y los metadatos relacionados para estas secuencias. En el caso de las secuencias humanas de SARS-CoV-2, los nombres de las cepas asociadas y los números de acceso de GISAID se pueden encontrar en los Datos complementarios 8. Para acceder a la base de datos de GISAID, los usuarios deben iniciar sesión siguiendo las instrucciones proporcionadas por la base de datos de GISAID. Una vez iniciada la sesión, la base de datos GISAID permite a los usuarios buscar y recuperar datos de secuencias y metadatos utilizando un número de acceso específico o un nombre de cepa específico. Además, se puede acceder a otros datos públicos utilizados en este estudio desde GISAID y GenBank, NCBI. Además, se puede acceder a los datos originales utilizados para generar gráficos de barras y visualizaciones geoespaciales en el archivo de datos de origen. Los datos originales se proporcionan con este documento.

Los códigos fuente de los scripts utilizados para los análisis moleculares están disponibles en https://github.com/FluSysBio/WTD_SARS-CoV-2_Transmission y también se puede acceder a ellos en https://doi.org/10.5281/zenodo.801075867.

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Descargar referencias

Este proyecto está financiado por la disposición de la Ley del Plan de Rescate Estadounidense para realizar monitoreo y vigilancia de animales susceptibles al SARS-CoV-2 (Número de subvención: AP22WSNWRC00C019 a XFW). CYT recibió el apoyo de una subvención de capacitación del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas de los Institutos Nacionales de Salud con el número de premio F30AI172230. Agradecemos a los empleados federales de USDA APHIS Wildlife Services y a los colaboradores de las agencias estatales de vida silvestre por contribuir con su experiencia en muestreo de vida silvestre, así como a los cazadores por participar en este esfuerzo a gran escala. También nos gustaría agradecer a Robert Pleszewski, Christopher Quintanal, Joshua Eckery y Jason Klemm del Centro Nacional de Investigación de Vida Silvestre APHIS del USDA, por la evaluación de laboratorio de muestras de hisopos y de Nobuto. Agradecemos a Rich Chipman, Dennis Kohler, Derek Collins, Kelsey Weir, Tim Linder, Jourdan Ringenberg y Jon Heale por su ayuda en el desarrollo e implementación del proyecto y a Kim Pepin, Joshua Hewitt y Cheng Gao por su discusión crítica. Además, nos gustaría agradecer al Dr. Jun Hang y Tao Li por secuenciar los virus humanos SARS-CoV-2 utilizados en este estudio, y a Kritika Prasai por generar los archivos bam utilizados para los análisis de polimorfismo. Los hallazgos y conclusiones de este informe son responsabilidad de los autores y no necesariamente representan la posición oficial del gobierno de los Estados Unidos.

Centro de Influenza y Enfermedades Infecciosas Emergentes, Universidad de Missouri, Columbia, MO, EE. UU.

Aijing Feng, Cynthia Y. Tang y Xiu-Feng Wan

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Xiu Feng Wan

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Conceptualización: TJD, SS, JC, MT y XFW Metodología: AF, JC, AR, KL, MT, XFW Investigación: AF, SB, JC, TJD, RG, KL, JL, AR, SS, CYT, SST, MT , AU, XFW Visualización: AF, TJD, XFW Adquisición de fondos: TJD, JL, XFW Administración de proyectos: TJD y XFW Supervisión: TJD, JL, SB, JC, SST, MT, XFW Escritura, borrador original: AF y XFW Escritura, revisión y edición: AF, SB, JC, TJD, RG, AR, SS, CYT, SST, XFW

Correspondencia a Thomas J. DeLiberto o Xiu-Feng Wan.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado al autor(es) original(es) y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

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Feng, A., Bevins, S., Chandler, J. et al. Transmisión del SARS-CoV-2 en venados de cola blanca en libertad en los Estados Unidos. Nat Comuna 14, 4078 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39782-x

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Recibido: 07 de febrero de 2023

Aceptado: 29 de junio de 2023

Publicado: 10 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39782-x

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