monocito

Nature Microbiology volumen 8, páginas 833–844 (2023)Cite este artículo

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El desarrollo de reservorios celulares persistentes del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) latente es un obstáculo crítico para la erradicación viral, ya que el rebote viral tiene lugar una vez que se interrumpe la terapia antirretroviral (TAR). Estudios anteriores muestran que el VIH persiste en las células mieloides (monocitos y macrófagos) de la sangre y los tejidos de personas con VIH virológicamente suprimidas (vsPWH). Sin embargo, aún no está claro cómo contribuyen las células mieloides al tamaño del reservorio del VIH y qué impacto tienen en el rebote después de la interrupción del tratamiento. Aquí informamos el desarrollo de un ensayo de crecimiento viral cuantitativo de macrófagos derivados de monocitos humanos (MDM-QVOA) y ensayos de detección de células T altamente sensibles para confirmar la pureza. Evaluamos la frecuencia del VIH latente en monocitos utilizando este ensayo en una cohorte longitudinal de vsPWH (n = 10, 100% hombres, duración del TAR de 5 a 14 años) y encontramos que la mitad de los participantes mostraron VIH latente en monocitos. En algunos participantes, estos reservorios pudieron detectarse durante varios años. Además, evaluamos los genomas del VIH en monocitos de 30 vsPWH (27% hombres, duración del TAR de 5 a 22 años) utilizando un ensayo de ADN proviral intacto (IPDA) adaptado a mieloides y demostramos que los genomas intactos estaban presentes en el 40% de los participantes y más. El ADN total del VIH se correlacionó con reservorios latentes reactivables. El virus producido en MDM-QVOA era capaz de infectar células circundantes, lo que provocaba la propagación viral. Estos hallazgos proporcionan evidencia adicional de que las células mieloides cumplen con la definición de reservorio de VIH clínicamente relevante y enfatizan que los reservorios mieloides deben incluirse en los esfuerzos hacia una cura del VIH.

Varias líneas de evidencia muestran que el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) persiste en los monocitos sanguíneos y los macrófagos tisulares en personas con VIH virológicamente suprimidas (vsPWH)1. Se ha detectado ADN del VIH en monocitos altamente purificados1,2,3,4,5 y macrófagos aislados de la uretra6, el intestino7, el hígado8 y el cerebro9,10 de vsPWH. Además, el virus de los reservorios de macrófagos puede rebotar y volver a sembrar el reservorio al interrumpir el tratamiento. Los datos de la cohorte Last Gift muestran que el cerebro infectado puede repoblar los reservorios virales durante el rebote11. Sin embargo, se sabe poco sobre el tamaño del reservorio mieloide (monocitos/macrófagos). La restricción mieloide específica de la reversión de la latencia del VIH y la localización tisular puede hacer que el reservorio mieloide sea más difícil de erradicar. Hay estudios limitados que investigan si el VIH en monocitos puede reactivarse para producir virus infecciosos en vsPWH. Los pocos estudios que han intentado evaluar los reservorios reactivables en monocitos12,13 a menudo utilizaron ensayos no optimizados para la biología única de estas células, lo que generó resultados mixtos. Actualmente, no existen métodos estandarizados y reproducibles para evaluar la reactivación del VIH a partir del reservorio de monocitos y aún tenemos que dilucidar el papel que desempeñan los monocitos en el mantenimiento de los reservorios de macrófagos tisulares. Los monocitos que contienen virus con capacidad de replicación pueden volver a sembrar reservorios de macrófagos tisulares cuando salen de la sangre y diferenciarse en macrófagos derivados de monocitos (MDM). Por lo tanto, hemos desarrollado un ensayo cuantitativo de crecimiento viral MDM (MDM-QVOA) para el VIH. Hemos cuantificado los reservorios de MDM de ADN y con capacidad de replicación en una cohorte longitudinal de vsPWH y los comparamos directamente con los reservorios de células T CD4 en los mismos individuos.

Quince personas con VIH (PWH; 4 virémicas (v) y 11 PWH con supresión viral a largo plazo (vs), todos hombres) compusieron la cohorte QVOA. La cohorte del ensayo de ADN proviral intacto (IPDA) estuvo compuesta por 30 vsPWH (27% hombres). Los vsPWH utilizados en ambas cohortes recibieron TAR supresor a largo plazo entre 5 y 22 años y no se informaron picos virales durante el período de estudio. Los participantes se describen en la Tabla de datos ampliados 1.

El MDM-QVOA humano se desarrolló sobre la base de nuestros estudios previos de macacos con supresión de ART infectados con el virus de la inmunodeficiencia simia (VIS)14,15. Una crítica al uso del modelo SIV para investigar los reservorios de células mieloides es que los macacos no reciben tratamiento ART durante períodos prolongados en comparación con vsPWH. Por lo tanto, desarrollamos un MDM-QVOA humano utilizando sangre de vsPWH. Utilizando 1 participante virémico (CP55, Fig. 1a), determinamos la línea celular expansora adecuada para el ensayo. Los medios de comunicación por sí solos apoyaron el crecimiento viral, pero en menor medida. La adición de una línea celular expansora optimizó la propagación y detección del virus en el ensayo. Los monocitos se diferenciaron en condiciones homeostáticas (M0) de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) del donante y se activaron utilizando Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA) en presencia de MT-4, CEMx17414,15 y Molt-4-CCR517. Todas las líneas celulares tenían niveles iniciales comparables de CCR5, CXCR4 y CD4 (Datos ampliados, figura 1). Los MT-4 promovieron el virus liberado por los MDM y respaldaron la infección productiva durante la duración del ensayo. Las células Molt-4-CCR5 comenzaron a morir después de 10 días en cultivo y CEMx174 no propagó el virus de manera eficiente. Por lo tanto, las células MT-4 se utilizaron como línea celular expansora para futuros MDM-QVOA.

a, Para determinar la línea celular expansora apropiada, se activó un vPWH virémico con PMA en el contexto de MT-4, Molt-4-CCR5, CEMx174 y medios únicamente; la línea de puntos indica el límite de detección (LOD). b, Para determinar la mejor condición de activación, 7 participantes (n = 7, 4 vPWH y 3 vsPWH suprimidos viralmente) fueron activados con PMA, IL-4, TNF𝛼 y medios con y sin células expansoras MT-4; media ± sd c. Para determinar si los macrófagos derivados de monocitos seleccionados negativamente podrían reactivarse de manera similar a los macrófagos derivados de PBMC completas, comparamos 3 participantes (n = 3, 1 vPWH y 2 vsPWH) activados con PMA y cocultivados con MT- 4. d – f, para determinar el ensayo apropiado para detectar la contaminación de células T, en el pozo o mediante fagocitosis, evaluamos la expresión de ARN de CD3ε y TCRβ en células T CD4 aisladas de donantes sanos (HD). d, Las células T CD4 de 3 HD se diluyeron en serie, se lisaron y se extrajo el ARN para medir la expresión de TCRβ y CDε; la media ± sd TCRβ (e) y CDε (f) mostraron una variabilidad similar entre réplicas, excepto en el extremo inferior del ensayo. g, se aislaron células T CD4 de 8 HD; Se lisaron 1 x 106 CD4 por donante y se evaluó la expresión de CD3ε y TCRβ para determinar las copias de cada uno por célula; la barra indica el valor mediano. h, se cultivaron conjuntamente MDM sanos con células T CD4 VIH+ de dos donantes (CP11 y 21) con y sin activación de PMA para determinar si las células T CD4 VIH+ eran capaces de transferir ácidos nucleicos virales a MDM; n = 2. i, Un esquema del diseño experimental final de MDM-QVOA.

Datos fuente

Para maximizar la activación de las células MDM, probamos tres métodos de activación: PMA, TNF𝛼 e IL-4 (Fig. 1b). Utilizando MDM generados en condiciones M0 a partir de 7 participantes (4 virémicos y 3 suprimidos), PMA reactivó el VIH de manera más confiable en comparación con TNF𝛼 e IL-4, tanto en presencia como en ausencia de MT-4. Por lo tanto, se utilizó PMA para activar MDM para QVOA posteriores. Las condiciones de cultivo se establecieron utilizando MDM diferenciadas de PBMC totales por adherencia celular. Sin embargo, era preferible la purificación de monocitos utilizando perlas magnéticas para evitar la absorción de CD4 durante el proceso de diferenciación (Datos ampliados, figura 2). Los MDM de monocitos purificados y PBMC totales de los mismos donantes se evaluaron en las mismas condiciones de cultivo y fueron equivalentes (Fig. 1c).

Una preocupación principal de los ensayos de VIH mieloide es la contaminación de células T que contribuye a la señal observada. Por lo tanto, desarrollamos varios puntos de control en todo el MDM-QVOA para evaluar la presencia de células T, como se describe en los métodos bajo controles de pureza. Históricamente, hemos utilizado el ARN de TCRβ para determinar si las células T estaban presentes en el macrófago-QVOA de macaco14,15. Para determinar si el ARN de TCRβ también es apropiado para el MDM-QVOA humano, evaluamos el ARN de TCRβ y CD3ε8 en células T purificadas y cuantificamos sus niveles de expresión. Determinamos que las mediciones de ARN de TCRβ eran más sensibles y reproducibles en el extremo inferior del ensayo en comparación con CD3ε (Fig. 1d-f). Además, al evaluar el número de células (usando un gen de copia única, IFNβ) en células T CD4 purificadas simultáneamente con ARN de CD3ε y TCRβ, determinamos que podíamos recuperar una mediana de 150 copias de CD3ε y 174 copias de TCRβ por CD4 (CD3ε). rango de 100 a 590 copias y rango de TCRβ de 90 a 380 copias, Fig. 1g). Por lo tanto, dado que el ensayo de CD3ε no mejoró notablemente la detección de CD4, utilizamos el ensayo de ARN de TCRβ para detectar células T en QVOA posteriores. Estudios anteriores sugieren que los macrófagos se infectan mediante la fagocitosis de células T CD4 infectadas con VIH18,19,20. Para eliminar el potencial de la fagocitosis CD4 como fuente de señal en MDM-QVOA, diseñamos un experimento de control para evaluar si las células T CD4 VIH+ pueden transferir ácidos nucleicos virales a MDM sano en nuestras condiciones QVOA. No observamos transferencia de ácidos nucleicos virales (ARN o ADN) a MDM cuando cocultivamos células T CD4 VIH + de dos donantes con ART suprimido (CP11 y CP21) durante 12 días con y sin activación de PMA (Fig. 1h). Esto proporciona evidencia adicional de que una contaminación menor de CD4 en el MDM-QVOA no es responsable de la señal observada en el ensayo. La evaluación de estos experimentos condujo al desarrollo del ensayo MDM-QVOA descrito en los métodos y en la Fig. 1i.

Para evaluar el reservorio de monocitos en una pequeña cohorte de vsPWH (n = 10, todos hombres), obtuvimos muestras de sangre y medimos el ADN del VIH (gag) y el ARN (gag y tat/rev) en MDM y CD4 de la misma extracción de sangre ( Figura 2a). Evaluamos CD4 aislados de 10 participantes; todos tenían niveles indetectables o bajos de tat/rev (3/10 positivos, mediana de 3,1 copias por millón de células), niveles bajos de ARN gag (7/10 positivos, mediana de 4,3 copias por millón de células) y niveles altos de ADN gag (8 /10 positivos, mediana 1.514 copias por millón de células). También se evaluaron los MDM de los mismos 10 participantes, y 6 de 10 participantes se repitieron de 2 a 4 veces para un total de 16 a 20 puntos de datos. Los MDM tenían niveles indetectables o bajos de tat/rev (2/16 positivos, mediana de 2 copias por millón de células) y ARN gag (5/16 positivos, mediana de 2,5 copias por millón de células) y niveles bajos de ADN gag (20/20 positivos). , mediana 135,7 copias por millón de células). Para probar la variabilidad del ADN de la mordaza del VIH en MDM a lo largo del tiempo, evaluamos la mordaza en MDM generada a partir de 6 participantes en múltiples extracciones de sangre con aproximadamente 150 a 1300 días de diferencia. Todas las medidas de ADN estaban dentro de un registro (Fig. 2b), lo que sugiere que los niveles de ADN del VIH son estables en los MDM de estos participantes. En promedio, los MDM tenían un ADN del VIH 10 veces menor en comparación con sus homólogos CD4 (P <0,0001, Fig. 2a). Todas las muestras de MDM también se evaluaron para detectar contaminación de células T midiendo el ARN de TCRβ (Fig. 2c). Observamos poca o ninguna contaminación de células T, con solo un participante (CP56 visita 1) con 100 células T CD4+ por millón de células. Este participante tenía una medición de 1.885 copias de mordaza de VIH por millón de CD4; por lo tanto, una contaminación de 100 células probablemente contribuiría con 0,189 copias de gag. En la fracción de células MDM, este participante tenía 128 copias de gag por millón de MDM, por lo tanto, el 0,15% de la señal fue aportado por células T CD4. Además, en 4 participantes evaluamos el ADN gag del VIH en monocitos antes y después de la diferenciación de MDM (Fig. 2d). Todos (4/4) los individuos tenían ADN gag de VIH tanto en monocitos como en MDM en niveles similares. Por lo tanto, podemos afirmar con confianza que los MDM de estos vsPWH contienen ADN gag de VIH aproximadamente 10 veces menos que sus células T CD4 compatibles y en niveles similares a los de los monocitos antes de la diferenciación.

a, Se evaluaron diez vsPWH para detectar ADN gag de VIH, ARN gag y ARN tat/rev en células T CD4 aisladas (n = 10) y MDM (n = 20), 6 donantes se repitieron 2 a 4 veces. ****P < 0,0001, prueba t no apareada de dos colas. b, el ADN gag del VIH en MDM se evaluó en 6 donantes en múltiples extracciones de sangre con una diferencia de entre 150 y 1300 días. c, el número de células T CD4 por millón de células sembradas en cultivos de MDM, calculado utilizando porcentajes de ARN de TCRβ y CD4 en sangre completa; n = 15, 3 donantes se repitieron 2 a 3 veces, la línea indica la mediana. d, En un subconjunto de individuos, se evaluó el ADN gag del VIH en monocitos y MDM de la misma extracción de sangre; n = 4. e, Se aislaron monocitos y células T CD4 de 30 vsPWH y se evaluó el ADN proviral del VIH utilizando IPDA. Se compararon los niveles de genoma proviral intacto, 3' defectuoso, 5' defectuoso y total por millón de células entre tipos de células; intacto **P = 0,0014, 3' del *P = 0,03, 5' del ***P = 0,0005, total **P = 0,006, prueba t no apareada de dos colas. f, Comparación de niveles de genoma intacto en un subconjunto de participantes que tenían genomas intactos detectables tanto en CD4 como en monocitos; n = 12, prueba t pareada de dos colas. NS, no significativo. Cada punto de datos representa datos de un participante específico, los círculos son datos de CD4, los cuadrados son datos de monocitos o MDM y las líneas representan medianas.

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Para proporcionar más evidencia de la presencia de un reservorio de ADN del VIH en monocitos, completamos IPDA21 en monocitos y células T CD4 aisladas en la misma extracción de sangre de 30 vsPWH (Fig. 2e). Como se esperaba, el 100% de los participantes tenía provirus detectables en células T CD4 (mediana de 614 copias por millón de células), el 83% tenía provirus intactos detectables (25/30 positivos, mediana de valores detectables 46,3 copias por millón de células), el 93% tenía provirus detectables 5' provirus defectuoso (28/30 positivo, mediana de valores detectables 335 copias por millón de células) y el 97% tenía provirus 3' defectuoso detectable (29/30 positivo, mediana de valores detectables 295,3 copias por millón de células). Además, el 100% de los participantes evaluados tenían provirus detectables en monocitos (mediana de 32,8 copias por millón de células) en al menos una forma, el 40% tenían provirus intactos detectables (12/30 positivos, mediana de valores detectables 6,6 copias por millón de células), 90 El % tenía provirus detectables 5' defectuosos (27/30 positivos, mediana de valores detectables 21 copias por millón de células) y 3' defectuosos (27/30 positivos, mediana de valores detectables 13 copias por millón de células). Los datos de monocitos se informan después del ajuste para la contaminación de células T CD4 medida por citometría de flujo en el momento del aislamiento (descrito en la Tabla 2 de datos ampliados y métodos). En general, las células T CD4 tenían niveles más altos de provirus intactos, defectuosos en 3' y defectuosos en 5' en comparación con los monocitos. Sin embargo, al comparar el reservorio intacto en un subconjunto de participantes que tenían genomas intactos detectables en ambos tipos de células (12/30), la diferencia entre los tipos de células ya no era significativa, con la mediana de provirus intactos medida en 6,6 copias por millón de monocitos y 38,9 copias por millón de células T CD4 (P = 0,16, Fig. 2f). Estos datos proporcionan evidencia adicional de que los monocitos de vsPWH contienen genomas de ADN del VIH en niveles más bajos en comparación con sus contrapartes de células T CD4. Esto proporciona evidencia de que en un subconjunto de vsPWH, los monocitos contienen genomas de VIH intactos que pueden ser capaces de replicarse tras la diferenciación de monocitos.

La medición del ADN del VIH no se considera una evaluación precisa del reservorio competente para la replicación. Por lo tanto, evaluamos los reservorios reactivables utilizando QVOA específicos de células (Fig. 3a). Completamos QVOA de células T CD4 y MDM en 10 vsPWH y encontramos que 9/10 participantes tenían provirus reactivables en células T CD4 (mediana de 1,6 unidades infecciosas por millón de células (IUPM)), y 5/10 tenían provirus reactivables en MDM (mediana de 0,44 UIPM). El cincuenta por ciento tenía provirus inducibles en la fracción de células MDM a una tasa de aproximadamente 1 en 2,5 millones de células. Las purezas celulares, la entrada y los límites de detección se muestran en la Tabla de datos ampliados 3.

a, Se evaluaron diez vsPWH para detectar reservorios reactivables en células T CD4 y MDM aislados de la misma extracción de sangre utilizando los QVOA CD4 y MDM específicos de células. b, Cuatro participantes regresaron para una segunda visita entre 150 y 280 días después de la primera visita. Todos los participantes completaron una repetición de MDM-QVOA y un participante también completó una repetición de CD4-QVOA (CP36, círculo naranja). Dos de los 4 participantes regresaron para una tercera visita de seguimiento 1174 y 1502 días después de su primera visita para repetir el MDM-QVOA. c, Promedio de copias de ARN gag del VIH por millón de células sembradas en CD4 y MDM QVOA; n = 9 CD4 y n = 10 MDM, no significativo mediante prueba t no apareada. d, Los participantes con valores de IUPM detectables en MDM-QVOA tenían niveles más altos de ADN gag del VIH en comparación con aquellos con valores de IUPM indetectables; n = 9 detectables y n = 5 indetectables, prueba t de Student no apareada de dos colas P = 0,0122. e, los niveles de ADN de MDM se correlacionaron positivamente con los valores de IUPM de MDM; regresión lineal simple R2 = 0,48 y P = 0,04. f,g, Comparación de porcentajes de células inmunitarias en sangre de participantes con valores IUPM detectables (n = 10) e indetectables (n = 5) en MDM QVOA; monocitos totales (TLR2+/CD3−) y células T CD4 (f), y subconjuntos de monocitos (g).

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Como los MDM se diferencian de los monocitos (células que se cree que tienen una vida útil limitada en circulación (días)22 y una vida útil menos conocida en los tejidos (meses a años), la detección de provirus reactivables en un solo momento puede no ser indicativa de una reservorio persistente. Para determinar si los MDM contribuyen al reservorio persistente del VIH, es decir, se reactivan de manera reproducible con el tiempo, obtuvimos extracciones de sangre longitudinales de 4 participantes (Fig. 3b). Tres participantes tenían MPIU detectables (es decir, provirus reactivables) y 1 tenía un MPIU indetectable con el primer MDM-QVOA. Todos (3/3) los participantes con provirus reactivable en su primera visita también tuvieron provirus reactivable en su segunda visita. No hubo diferencias significativas en los valores de IUPM entre las visitas 1 y 2 (una mediana de 265 días de diferencia). Además, el participante con virus indetectable en el MDM-QVOA en la visita 1 también tenía virus indetectable en la visita 2 (con 146 días de diferencia). Como control, completamos un CD4-QVOA adicional en 1 participante y encontramos un valor de IUPM similar en la segunda visita (Fig. 3b, círculo naranja CP36). Para probar esto más a fondo, 2 participantes (CP11 y CP21) fueron evaluados por tercera vez utilizando el MDM-QVOA aproximadamente 3 a 4 años después de su visita inicial. Ambos participantes recibieron TAR supresivo durante todo el estudio sin episodios virales informados y tuvieron provirus reactivables en su tercera visita en valores similares en comparación con sus visitas anteriores. Para comparar la liberación viral entre CD4 y MDM QVOA, normalizamos la entrada celular del ensayo y determinamos las copias de ARN del VIH por millón de células sembradas. La mediana del número de copias de ARN del VIH detectadas en todos los ensayos MDM-QVOA positivos fue de 7,2 × 103 copias por millón de células (rango 1,4 × 103–3,5 × 105 copias por millón de células, Fig. 3c) en comparación con el ensayo CD4-QVOA con un mediana de 1,4 × 105 copias por millón de células (rango 1,2 × 103–8,9 × 105 copias por millón de células), y ambos números no fueron estadísticamente diferentes.

Ninguno de los MDM-QVOA tuvo una contaminación sustancial de CD4 medida por citometría de flujo antes del cultivo en placa y después de la diferenciación del ARN de TCRβ (Tabla 1 y Tabla de datos ampliados 3). De los 16 MDM-QVOA completados, observamos una mediana de 2,5% de contaminación de células T CD4 después de la selección (rango 0,2–25%; Tabla de datos ampliada 3) y células en placas que tenían una mediana de 75% de TLR2 positivas (rango 12–94,5 %, TLR2 se utiliza como marcador general de monocitos23; Tabla de datos ampliados 3). El 25% restante estaba compuesto por pequeños porcentajes de desechos, células T NK y CD8 que no se eliminaron de manera eficiente mediante el ensayo de selección negativa. Después de la diferenciación, hubo 1 participante con niveles elevados de ARN de TCRβ detectados (CP56, 100 CD4 por millón de células; Fig. 2e y Tabla 1). Sin embargo, este participante no tenía virus detectable en el MDM-QVOA. Todos los demás participantes tenían una mediana de 0,6 (rango 0-37) de células T CD4 calculadas en el pozo MDM-QVOA más grande o menos de 13 CD4 por millón de células. El porcentaje de probabilidad de que las células T CD4 VIH+ contribuyan a la señal observada en los MDM-QVOA osciló entre 0 y 0,03%. Estos datos sugieren fuertemente que las células T CD4 VIH+ no contribuyen a la señal observada en el MDM-QVOA. En general, estos datos muestran que los MDM no sólo contienen reservorios reactivables de VIH sino que estos reservorios pueden reactivarse con el tiempo. Esto apoya la hipótesis de que los monocitos podrían sembrar tejidos durante la supresión y el rebote viral.

Se ha demostrado que las mediciones del ADN gag del VIH en células T CD4 son una sobreestimación del reservorio competente para la replicación24. Sin embargo, este tipo de análisis nunca se ha completado para el reservorio mieloide. Por lo tanto, comparamos las copias de ADN de la mordaza del VIH por millón de células medidas en los participantes con IUPM por encima o por debajo del límite de detección de MDM-QVOA. Descubrimos que los participantes con provirus reactivable tenían niveles más altos de ADN del VIH en comparación con aquellos con virus indetectable (Fig. 3d, P = 0,0122). Para evaluar si los niveles de ADN del VIH eran representativos del tamaño del reservorio reactivable, correlacionamos las copias de ADN del VIH por millón de células y el IUPM de los ensayos de MDM. Descubrimos que el ADN y el IUPM de los MDM tenían una correlación positiva débil, con un R2 = 0,47 (Fig. 3e, P = 0,04). También comparamos los porcentajes de células T CD4, monocitos y subconjuntos de monocitos (clásicos, intermedios y no clásicos) en sangre completa con el resultado del MDM-QVOA. Descubrimos que no hubo diferencia entre los porcentajes de monocitos, células T CD4 o subconjuntos de monocitos con provirus reactivable versus virus indetectable en los MDM-QVOA (Fig. 3f, g), lo que sugiere que la presencia de un subconjunto de monocitos en particular no determina la capacidad de reactivar el embalse. En general, estos datos demuestran que una alta carga total de ADN del VIH en los MDM aumenta la probabilidad de que haya un reservorio reactivable de MDM.

Intentamos determinar si el virus producido en MDM-QVOA es capaz de infectar células T CD4 y, por lo tanto, contribuir a la propagación viral tras la interrupción del tratamiento analítico. Usando una cantidad estandarizada de VIH (800 copias de ARN gag por ml) de sobrenadantes de CD4 y MDM QVOA, espinoculamos MT-4 activados y descubrimos que el virus producido en MDM-QVOA es capaz de infectar y expandirse en una línea celular CD4 de manera similar al virus. aislados de CD4-QVOA (Fig. 4a, b). Una diferencia observada en la cinética viral entre los aislados de CD4 y los QVOA de MDM fue que algunos aislados de CD4 se expandieron exponencialmente, mientras que los aislados de MDM no se replicaron exponencialmente en cultivo. Es de destacar que hubo algunos aislados de ambos ensayos QVOA que no se replicaron (CP21 de CD4 y CP25 de MDM). Observamos una variedad de patrones de replicación de los aislados de MDM y CD4 de cada participante, estos patrones se informaron previamente en CD4-QVOA25 (Datos ampliados, figura 3). En general, estos datos sugieren que el virus liberado de los reservorios de MDM reactivados puede infectar a las células T CD4 transeúntes y contribuir al rebote viral después de la interrupción del tratamiento.

a, b, se utilizaron sobrenadantes de cultivo de QVOA para espinocular MT-4 y determinar si los aislados virales producidos en los QVOA son capaces de propagarse. Se muestran un pocillo CD4-QVOA positivo representativo de 4 vsPWH (a) y un pocillo MDM-QVOA positivo representativo de 5 vsPWH (b); La entrada viral se normalizó a 800 copias de ARN gag del VIH por ml. c, El gen nef se secuenció en dilución limitante de pocillos QVOA positivos en los ensayos de CD4 y MDM. Se alinearon las secuencias de Nef y se generó un árbol utilizando la estimación de máxima verosimilitud utilizando el método bootstrap para probar la filogenia (1000 replicaciones). Los resultados de Bootstrap están etiquetados en cada nodo participante; >80 se consideró significativo. Cada color representa un participante específico, los círculos indican secuencias de CD4, los cuadrados secuencias de MDM y el diamante la secuencia de referencia.

Datos fuente

Para determinar si existen distintas variantes del VIH en los cultivos de MDM en comparación con los cultivos de CD4, secuenciamos el gen nef de los QVOA de MDM y CD4 de 4 participantes. Descubrimos que las secuencias de MDM-QVOA se agruparon con sus contrapartes de CD4 como se esperaba, dado que fueron aisladas del mismo individuo (Fig. 4c), excepto CP25, cuya secuencia de MDM se agrupó con un individuo diferente (CP36) en el árbol. Sin embargo, el valor de arranque no fue significativo (>80 se considera significativo), lo que sugiere que esta secuencia puede estar agrupada aleatoriamente con CP36 y es una secuencia atípica. Además, al evaluar la secuencia de nucleótidos, observamos que el aislado CP25-MDM tenía mutaciones distintas de los aislados CP25-CD4 y CP36-CD4 y MDM (Datos ampliados, figuras 4 y 5). Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que se trataba de una secuencia precisa de CP25 MDM-QVOA y no del resultado de una contaminación. Esto sugiere que este individuo podría haber sido infectado con más de un virus fundador transmitido. Además, secuenciamos nef de varios pocillos positivos de MDM y CD4 QVOA del participante CP36. Las secuencias nef de los dos pocillos MDM positivos eran idénticas pero todas las secuencias nef de CD4 eran distintas. Aunque esto no indica clonalidad por parte de los MDM, ya que es solo una fracción de la secuencia viral completa, sí sugiere que nef puede conservarse en los MDM en comparación con los CD4, ya que las secuencias provenían de pocillos QVOA independientes. Estos datos demuestran que la reactivación de MDM podría producir virus distintos a partir de CD4 aislados del mismo participante.

Los reservorios celulares persistentes de VIH latente son un obstáculo crítico para la erradicación viral. Nuestros hallazgos demuestran que aproximadamente entre el 40% y el 50% de los vsPWH albergan virus latentes reactivables en MDM, lo cual es notable ya que los monocitos no se tienen en cuenta en los esfuerzos basados ​​en la cura. Aquí cuantificamos el reservorio de monocitos en vsPWH utilizando dos técnicas independientes: QVOA e IPDA. El porcentaje de vsPWH con un reservorio de monocitos es solo una estimación, ya que es posible que no hayamos podido activar de manera óptima los MDM aislados de todos los participantes debido a diferencias en la detección innata de los macrófagos26 y desafíos en la detección del ADN del VIH de participantes con cargas virales más pequeñas27,28,29. Además, proporcionamos evidencia de que el reservorio de MDM es estable y persistente en vsPWH a largo plazo, ya que medimos el reservorio de MDM en los mismos participantes durante un período de 9 meses a 4 años. Dado que los monocitos circulantes tienen una vida útil de 72 h en la sangre, estos datos respaldan dos posibles hipótesis sobre el mantenimiento del reservorio mieloide. Primero, que la médula ósea contiene un virus latente que siembra monocitos en la sangre. Estudios previos demuestran que el VIH puede infectar células progenitoras hematopoyéticas (médula ósea) in vivo e in vitro, provocando infección citotóxica activa e infección latente30,31,32. Esto está respaldado por la detección de virus y provirus reactivables en MDM a lo largo del tiempo. También sugiere que estamos midiendo el mismo reservorio a lo largo del tiempo, mientras que los nuevos monocitos derivan de los mismos progenitores infectados. Este es un tema poco estudiado y divisivo, ya que algunos estudios también indican que las células CD34+ en la médula ósea no contienen provirus del VIH33 y la purificación de este tipo de células puede ser un problema34. La segunda hipótesis es que la replicación en curso se produce en un tejido desconocido, potencialmente el bazo o el ganglio linfático, lo que lleva a una infección constante de los monocitos circulantes. Esta hipótesis está respaldada por el hallazgo de que los monocitos CD16+ se infectan preferentemente in vivo y ex vivo35, ya que son el subconjunto de monocitos que se cree que atraviesan los tejidos y regresan a la circulación36. Sin embargo, nuestros datos no respaldan esto, ya que los monocitos requieren diferenciación y activación sustancial para producir virus en cultivo, y no detectamos ARN del VIH en estas células, lo que sugiere que el virus está latente. Además, estudios previos sugieren una falta de evolución viral continua en los tejidos durante el TAR, lo que sería de esperar si hubiera una replicación de bajo nivel responsable de la infección continua de monocitos37,38. En general, se necesitan más estudios para determinar cómo se establece y mantiene el reservorio de monocitos.

A lo largo de décadas de investigación sobre el VIH, ha habido evidencia de que las células mieloides desempeñan un papel en el reservorio latente. Los primeros estudios de inicio de TAR informaron una disminución en dos fases de la viremia en plasma, atribuyendo la segunda fase más lenta de disminución a las células de vida más larga, como los macrófagos39,40. Además, el VIH persiste en monocitos y macrófagos de la sangre y los tejidos, ya que se ha detectado ADN del VIH en monocitos altamente purificados1,2,3,4,5 y macrófagos tisulares6,7,8,9,10 de vsPWH. Un estudio reciente demostró una nueva comprensión mecanística de la persistencia del VIH en los macrófagos tisulares de vsPWH, lo que sugiere que las vías metabólicas pueden controlar la latencia en los macrófagos41. En modelos animales, un modelo de VIH en ratón sólo mieloide demostró que los monocitos y los macrófagos pueden mantener la infección independientemente de las células T CD442 y que el VIH persiste en los macrófagos tisulares durante la supresión del TAR43. Los modelos de macacos de VIS suprimido informan reservorios mieloides con capacidad de replicación en sangre y tejidos de animales que han estado suprimidos durante más de 20 meses15. Además, esto no es exclusivo del VIH, ya que otros lentivirus infectan preferentemente y se integran en los genomas del huésped de las células mieloides, creando reservorios de larga duración44,45. Estos estudios resaltan la importancia de las células mieloides como reservorio del VIH, y se necesitan más estudios para comprender el mecanismo que impulsa su persistencia y las posibles estrategias para su eliminación.

Existen varias limitaciones en este estudio. Primero, solo analizamos a 10 participantes mediante MDM-QVOA y 30 participantes mediante IPDA. Por lo tanto, nuestros hallazgos pueden no ser una representación precisa del porcentaje de vsPWH que contienen VIH latente en monocitos. En segundo lugar, no abordamos los macrófagos de tejido con infección latente, ya que son más difíciles de acceder en humanos. Se necesitan estudios futuros que incluyan más vsPWH, macrófagos tisulares y análisis de secuencia más detallados. A pesar de estas limitaciones, proporcionamos evidencia de que los monocitos de vsPWH a largo plazo contienen VIH latente persistente que, tras la reactivación, es competente para replicarse y capaz de propagarse viralmente. Este estudio proporciona evidencia directa de que los reservorios de monocitos deberían incluirse en los esfuerzos de curación del VIH.

Se obtuvieron muestras de sangre de donantes sanos y VIH positivos con consentimiento informado por escrito y posteriormente se manipularon de acuerdo con los protocolos aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Johns Hopkins. Las características de la cohorte se informan en la Tabla de datos ampliados 1.

Las muestras de sangre total se tiñeron con anticuerpos pretitulados utilizando 100 µl de sangre total a temperatura ambiente durante 20 minutos. El panel de anticuerpos y las diluciones se enumeran en la Tabla complementaria 1. Luego, las muestras de sangre completa se lisaron y se fijaron en 2 ml de solución de lisis FACS (BD Biosciences) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se recogieron en una centrífuga a 400 x g durante 5 minutos, se lavaron en 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1 x y luego se resuspendieron en 0,5 ml de PBS para su análisis. La pureza se evaluó después de la selección mediante citometría de flujo. Las PBMC se tiñeron antes del aislamiento y después de la selección de panmonocitos con anticuerpos monoclonales pretitulados y un indicador de viabilidad. El panel de anticuerpos y las diluciones se enumeran en la Tabla complementaria 1. Se utilizó TLR2 como marcador general de células monocíticas como se publicó anteriormente23. Las PBMC se tiñeron, adquirieron y analizaron como se describe anteriormente. Las purezas de selección se informan en la Tabla de datos ampliados 3. En casos seleccionados, las evaluaciones de pureza de MDM 7 días después de la diferenciación también se completaron mediante citometría de flujo. Los MDM diferenciados de los donantes sanos se retiraron de la placa con TrypLE (Gibco). El panel de anticuerpos y las diluciones se enumeran en la Tabla complementaria 1. En resumen, las células se tiñeron con anti-CD3 y LIVE/DEAD durante 30 minutos a 4 °C. Luego, las células se permeabilizaron utilizando Biolegend PermFast y se tiñeron con anti-CD68 o control de IgG compatible. La citometría de flujo se realizó en un BD LSRFortessa (BD Biosciences). Los ajustes de voltaje se estandarizaron para los controles diarios de CS&T Research Bead (BD Biosciences) utilizando ajustes de aplicación predeterminados en FACSDiva 6.2 para garantizar que la intensidad fluorescente fuera consistente longitudinalmente. Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo 10.0.8 (FlowJo). La estrategia de activación representativa se muestra en los datos extendidos, figuras 6a a d.

Se probaron tres líneas celulares de linfocitos durante el desarrollo de MDM-QVOA: línea celular MT-4 obtenida a través del Programa de Reactivos para VIH de NIH, División de SIDA (NIAID, NIH: células MT-4, ARP-120, aportado por el Dr. Douglas Richman (n° cat. 120)46,47,48); MOLT-4-CCR5 donado amablemente por el Dr. Robert F. Siliciano de la Facultad de Medicina Johns Hopkins; y CEMX174 comprado a ATCC. Todas las líneas celulares se propagaron y mantuvieron en R10 (medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 %, 100 U de penicilina por ml y 100 µg de estreptomicina por ml). Los MOLT-4-CCR5 se cultivaron en presencia de G418 (1 mg ml-1) para mantener la expresión de CCR5. En todas las líneas celulares se evaluaron los receptores y correceptores necesarios para la entrada del VIH mediante citometría de flujo. El panel de anticuerpos y las diluciones se enumeran en la Tabla complementaria 1. La tinción de anticuerpos se completó como se describe anteriormente.

Se obtuvo sangre completa de personas con VIH virémicas (v) y con supresión viral (vsPWH) para el aislamiento de PBMC mediante centrifugación en gradiente de Ficoll. Luego, las PBMC se utilizaron en VOA para determinar las condiciones apropiadas para el desarrollo de QVOA. Todos los VOA se completaron en MDM derivados de PBMC frescos nunca congelados o monocitos aislados negativamente (kit de aislamiento Pan Monocitos, humanos; Miltenyi Biotec). Se sembraron PBMC o monocitos aislados a una densidad de 2 a 5 × 106 células por pocillo y se cultivaron en MDM10 + ARV (medio Eagle modificado por Dulbecco (Life Technologies) suplementado con suero AB de tipo humano inactivado por calor al 10% (Gemini Bio Products)). , 100 U ml-1 de penicilina-estreptomicina (Life Technologies), 20 μg ml-1 de gentamicina (Life Technologies), l-glutamina 2 mM (Life Technologies), piruvato de sodio 2 mM (Sigma), tampón HEPES 10 mM (Life Technologies ) y 50 ng ml-1 de factor estimulante de colonias de macrófagos humanos recombinantes (I+D) que contienen fármacos antirretrovirales (zidovudina 10 μM (Sigma), darunavir 25 nM (Janssen) y raltegravir 5 nM (Merck)). Estas se consideran condiciones M0 y dan como resultado la diferenciación de macrófagos sin polarización16. Cada 3 días después de la siembra, se eliminó la mitad del medio y los cultivos se repusieron con MDM10 + ARV fresco. Se permitió que los monocitos se diferenciaran en estas condiciones durante 7 días. Una vez que se diferenciaron los MDM, las células se lavaron dos veces con PBS estéril, se trataron con tripsina al 0,025 % (5 minutos a temperatura ambiente) y luego se lavaron dos veces con PBS estéril nuevamente para garantizar que se eliminaran todas las células contaminantes y que solo permanecieran en cultivo las células adherentes. Luego, las células se activaron con MDM10 que contenía uno de los siguientes agentes activadores: 20 ng ml-1 de factor de necrosis tumoral (TNF𝛼, ProSpec), 0,5 µM ml-1 de PMA (Sigma) y 10 ng ml-1 de interleucina-4 (IL- 4, perspectiva). Se agregaron líneas celulares de linfocitos al cultivo para expandir el virus liberado de las células infectadas. Las líneas celulares probadas en los VOA fueron MT-4, MOLT-4-CCR5 y CEMX174 con una densidad de 1 × 106 por pocillo. Las condiciones del ensayo incluyeron MDM10 más un reactivo de activación (PMA, TNA o IL-4) y línea celular (MT-4, MOLT-4-CCR5 o CEMx174), MDM10 más un reactivo de activación solo, MDM10 más una línea celular sola y MDM10 solo. . Se recogió el sobrenadante (1 ml) los días 2, 4, 6, 8, 10 y 12 y se reemplazó con MDM10 fresco que contenía únicamente el reactivo de activación respectivo o el medio. El ARN viral se aisló de 1 ml de sobrenadante de VOA en cada momento utilizando el kit de vacío de virus QIAamp MinElute (Qiagen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, y las muestras se evaluaron para determinar la expresión del ARN gag del VIH mediante RT-qPCR como se describe a continuación.

Aquí se informa el ensayo final utilizado en todo el manuscrito. Se aislaron PBMC humanas de vsPWH como se describió anteriormente. Dos tercios de las PBMC aisladas se utilizaron para el aislamiento de monocitos negativos (kit de aislamiento Pan Monocitos, humano; Miltenyi Biotec) y las PBMC restantes se reservaron para el ensayo CD4-QVOA (consulte el ensayo CD4-QVOA a continuación para obtener más detalles). Después del aislamiento de panmonocitos, se reservaron 5 x 105 células para una evaluación de la pureza mediante citometría de flujo, se sembraron 2 x 106 células para pocillos de control de células T (1 x 106 por pocillo) y las células restantes se sembraron por duplicado a 5 veces. dilución limitante (Fig. 1b). Todas las células sembradas se cultivaron en MDM10 + ARV (descrito anteriormente). Los monocitos se cultivaron durante 7 días para permitir la diferenciación en MDM. MDM10 + ARV se cambió cada 3 días para evitar la propagación viral en cultivo. El día 7, los MDM se lavaron 2 veces con PBS estéril, 1 vez con tripsina al 0,025 % (5 min a temperatura ambiente) y 2 veces más con PBS para garantizar que se eliminaran todas las células contaminantes y solo quedaran los MDM adherentes. Luego se activaron los MDM con PMA 0,5 µM ml-1 y se agregaron 1 x 104-106 células expansoras MT-4 por pocillo, excluyendo los pocillos de control de células T. Los sobrenadantes se recogieron y se repusieron con MDM10 + PMA recién creado cada 3 días y se evaluaron para detectar el ARN gag del VIH mediante RT-qPCR. Los sobrenadantes de los puntos temporales de activación temprana (días 10 y 13) y los sobrenadantes de puntos temporales posteriores (días 16 y 19) se agruparon y evaluaron para determinar el ARN viral como se describe a continuación. Las células se recogieron el día 19 y se lisaron en tampón AllPrep (RLT plus y beta-mercaptoetanol al 1 %, βME) para el aislamiento de ARN y ADN (ver más abajo). La frecuencia de células que albergan virus con capacidad de replicación se determinó utilizando la calculadora de frecuencia de infección IUPMStats v1.0 y se expresó como IUPM49. Los pozos se consideraron positivos si el punto temporal temprano o tardío tenía un valor de umbral de ciclo (Ct) menor o igual a 35 medido por RT-qPCR. Todos los MDM-QVOA se evaluaron para detectar contaminación de células T CD3 + mediante RT-qPCR para TCRβ (ver más abajo).

Todas las muestras de monocitos seleccionadas se analizaron mediante citometría de flujo para determinar el porcentaje de células T contaminantes antes de sembrar. Una vez sembradas, las células se cultivaron en presencia de ART durante 7 días para su posterior purificación por adherencia. Una vez diferenciados los macrófagos, se lavaron extensamente con PBS y un bajo porcentaje de tripsina para eliminar las células no adherentes. Se mantuvieron dos pocillos, con un mínimo de 1 x 106 monocitos por pocillo, como controles de células T y no se agregaron MT-4. Al final del ensayo (día 19), los pocillos de control se lisaron y se evaluaron para detectar contaminación de células T mediante qPCR para el ARN del receptor beta de células T (TCRβ). El propósito de evaluar el TCRβ después de la activación de MDM es permitir que las células T contaminantes se expandan y sean más fáciles de detectar. Durante el desarrollo del ensayo, también evaluamos los MDM con y sin activación para detectar contaminación de células T mediante citometría de flujo y no observamos células CD3+ contaminantes (Datos ampliados, figura 6e). Además, se completaron CD4-QVOA en la misma extracción de sangre para que todos los participantes actuaran como control positivo. Luego, estas mediciones se usaron para calcular matemáticamente el porcentaje de probabilidad de que la contaminación de células T CD4 VIH+ en el ensayo contribuya a nuestra señal positiva (descrita a continuación y Tabla de datos ampliados 4).

Se utilizaron pocillos de control de células T sin células MT-4 para los análisis de ARN de TCRβ. Durante el desarrollo del ensayo, probamos dos métodos para detectar células T CD3+ en los pocillos de MDM: CD3ε y TCRβ. La expresión de ARN de CD3ε y TCRβ se cuantificó utilizando cebadores, sondas y condiciones de reacción enumeradas en las Tablas complementarias 1 y 2. Todas las muestras se cuantificaron utilizando curvas estándar de ARN específicas del objetivo. En el ensayo final de MDM-QVOA, se usó TCRβ para estimar el número absoluto de células T CD3+ en MDM-QVOA (consulte la Tabla de datos ampliados 4 para ver ejemplos de cómo calculamos el número de células CD3+ en los pocillos de control de células T). En resumen, evaluamos el número de copias de ARN de TCRβ y el número de células (IFNβ) en la misma muestra (ARN y ADN aislados mediante AllPrep, ver más abajo). Se determinó que el número medio de copias de TCRβ por célula era 174 utilizando células T CD4 aisladas de 10 donantes sanos. Por lo tanto, dividimos la señal total de TCRβ por 174 para igualar las células CD3+ en el pocillo de MDM. Luego utilizamos el número de células, calculado mediante la señal de IFNβ dividida por 2 (2 copias por célula), para determinar el número de células CD3+ por millón. A continuación, multiplicamos las células CD3+ por millón por la cantidad de células presentes en el pozo MDM-QVOA más grande, ya que aquí es donde encontramos nuestra señal positiva la mayor parte del tiempo. Una vez que tuvimos las células CD3+ en el pozo MDM-QVOA más grande, multiplicamos este número por el porcentaje de células T CD4 en la sangre total en el momento de la extracción para determinar cuántas células CD3+ también eran CD4+. Usando este número, calculamos la probabilidad de que este número de células T CD4 pudiera haber contribuido a nuestra señal positiva usando el valor de CD4 IUPM del mismo individuo. Luego, la probabilidad se multiplicó por 100 para estimar el porcentaje de probabilidad de que nuestra señal procediera de una célula T CD4 VIH+.

Se aislaron PBMC de sangre entera de donante sano y se aislaron monocitos usando el kit de selección de monocitos pan como se describió anteriormente. Luego, los monocitos se sembraron en placas con 500.000 células por pocillo y se diferenciaron en condiciones M0 durante 7 días. El día 7, los MDM se lavaron como se describe anteriormente y las células T CD4 aisladas de dos donantes VIH + (CP11 y 21) se agregaron por triplicado a los pocillos de MDM (rango 1 x 104-101 células). Los cocultivos de MDM + VIH+ CD4 se mantuvieron durante 12 días con y sin activación de PMA. El día 12, los MDM se lavaron y lisaron, y se evaluaron el ARN y el ADN del VIH asociados a células como se describe a continuación.

Los ensayos de CD4-QVOA se realizaron como se describió anteriormente17. En resumen, se aislaron células T CD4 de las PBMC restantes utilizando un kit de selección de CD4 negativo (kit Neg CD4, Miltenyi Biotec), se sembraron en placas con una dilución limitante de 5 veces y se cultivaron en medio de células súper T. Las células se activaron con 0,5 μg ml-1 de fitohemaglutinina (Remel) y 10–2,5 × 106 PBMC irradiadas de un donante sano (alimentadores) durante un mínimo de 16 h. Luego se eliminó la fitohemaglutinina y se agregaron 1–0,5 × 106 MT-4 a cada pocillo. Los sobrenadantes y las células se recogieron el día 7. Se evaluó el ARN gag del VIH en los sobrenadantes y las células se lisaron en tampón AllPrep (RLT plus+βME) para el aislamiento de ARN y ADN (ver más abajo).

Se aisló ARN viral de 1 ml de sobrenadante de MDM-QVOA de cada dilución en serie por duplicado utilizando el kit de vacío de virus QIAamp MinElute (Qiagen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se aisló ARN viral de 0,2 ml de sobrenadante de CD4-QVOA utilizando el kit de centrifugación de virus QIAamp MinElute (Qiagen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se realizó una digestión con DNasa en columna para todas las muestras de QVOA utilizando el kit de DNasa libre de RNasa (Qiagen) y 3 U de RQ1 DNasa (Promega), y las columnas se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. El ARN viral aislado de los sobrenadantes de MDM-QVOA y CD4-QVOA se evaluó mediante RT-qPCR utilizando el kit de virus QuantiTect (Qiagen). Los cebadores, las sondas y las condiciones de reacción se enumeran en las Tablas complementarias 2 y 3. Para controlar la contaminación del ADN, se analizó una reacción sin transcriptasa inversa. Las muestras se cuantificaron utilizando la curva estándar de ARN gag de VIH.

Los genes de ARN celular gag y tat/rev de ARN del VIH se aislaron de las células utilizando el mini kit AllPrep DNA/RNA (Qiagen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los cebadores, las sondas y las condiciones de reacción se enumeran en las tablas complementarias 2 y 3. Las muestras se cuantificaron utilizando curvas estándar de ARN específicas del objetivo.

Las muestras de ADN se aislaron de las células utilizando el mini kit AllPrep DNA/RNA según las recomendaciones del fabricante. El ADN viral se midió en las células utilizando la qPCR múltiple con el kit MP (Qiagen). Los cebadores, las sondas y las condiciones de reacción se enumeran en las Tablas complementarias 2 y 3. Para la normalización de la muestra y la cuantificación celular, evaluamos un gen de copia única, el interferón beta humano (IFN-β), utilizando cebadores, sondas y condiciones de reacción enumeradas en las Tablas complementarias 2 y 3. Tablas 1 y 2. Las muestras se cuantificaron utilizando curvas estándar de ADN específicas del objetivo y se normalizaron mediante la entrada del número de células.

Realizamos IPDA como se describe para medir por separado el ADN proviral genéticamente intacto y defectuoso (3' eliminado/hipermutado y 5' eliminado), con modificaciones menores realizadas para la evaluación de monocitos. En resumen, se aislaron monocitos TLR2+ de las PBMC participantes utilizando el kit de microperlas anti-biotina (Miltenyi Biotec) y un anticuerpo TLR2 biotinilado (1 μg por 107 células del clon TL2.1, Invitrogen). Luego se aislaron células T CD4 de las células negativas para TLR2 restantes utilizando un kit de selección de CD4 negativo (kit Neg CD4, Miltenyi Biotec). Luego se evaluó la pureza de las células seleccionadas mediante citometría de flujo (ver más arriba para más detalles) y se lisaron en tampón AllPrep (RLT plus + βME) para el aislamiento del ADN (ver arriba). Todos los cebadores, sondas y condiciones de reacción utilizados para IPDA se enumeran en las Tablas complementarias 1 y 2. Las muestras se analizaron por triplicado, o si no se observó señal, hasta que se adquirieron un mínimo de 1 × 106 células, según se determinó midiendo el gen celular. RPP30. Para estimar la señal de CD4 que podría haber contribuido a los resultados observados en el IPDA de monocitos, utilizamos los valores evaluados en el IPDA de CD4 y el %CD3+/CD4+ determinado por citometría de flujo. Calculamos matemáticamente el número de células T CD4 presentes en un millón de monocitos, la señal potencial intacta, 3' del o 5' del en esas células y restamos esa señal de la señal IPDA de los monocitos. Por ejemplo, la muestra 1 tenía un 2 % de células T CD4 en los monocitos seleccionados y 10 genomas intactos por millón de células T CD4. Estimaríamos que había 20.000 células T CD4 en 1 × 106 monocitos (2 x (1 × 106 células) / 100) y 0,2 copias intactas procedían de CD4 contaminantes (10 intactas / (1 × 106 células) x 20.000 CD4), y luego eliminaríamos este último valor de la señal IPDA de monocitos. Los datos de IPDA de monocitos antes y después del ajuste de CD4 se pueden encontrar en la Tabla 2 de datos ampliados. Todos los datos informados en este manuscrito están ajustados para CD4 pero no para el cizallamiento del ADN para evitar aumentos artificiales en los valores intactos informados.

Se espinocularon MT-4 (2 × 106) (2 h a 1200 × g, temperatura ambiente) con 500 μl de sobrenadante de pocillos positivos de MDM o CD4 QVOA con muestra disponible. La entrada viral se normalizó a 800 copias de VIH gag para cada muestra. Después de la espinoculación, las células se lavaron una vez con PBS estéril y se resuspendieron en 2 ml de R10, se sembraron en una placa de 24 pocillos y se incubaron a 37 °C. Los sobrenadantes se recogieron los días 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18 y 21 después de la espinoculación y se reemplazó medio nuevo en cada momento. En los días 6 y 12 después de la espinoculación, todos los cultivos se complementaron con 1 × 106 MT-4 adicional y se repitió la espinoculación. El ARN se aisló de 1 ml de muestra utilizando un kit de vacío para virus QIAamp MinElute (Qiagen) y el ARN gag del VIH se cuantificó mediante RT-qPCR como se describió anteriormente.

El ADN se extrajo de células QVOA (MDM y CD4) utilizando el kit AllPrep siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las PCR de dilución limitante para obtener clones de nef se realizaron como se describió anteriormente50,51. En resumen, el ADN se utilizó en un protocolo de PCR de dilución limitante anidada utilizando Platinum Taq HiFi (Life Technologies). Las PCR externas se diluyeron 1:3 con agua desionizada y se usaron 10 µl de ADN de PCR externa para la amplificación anidada de nef de longitud completa (661 pb). Los conjuntos de cebadores y las condiciones se enumeran en las Tablas complementarias 1 y 2 y se publicaron anteriormente52. La clonalidad se determinó mediante estadística de Poisson y se consideró clonal 2 positivos por cada 10 pocillos amplificados. Los productos de la PCR se visualizaron utilizando geles de agarosa al 1% y se aislaron utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen). Los productos fueron enviados para secuenciación Sanger. Las secuencias de contig se generaron utilizando el alineador CodonCode (v9), las alineaciones se realizaron mediante el método Bioedit Clustal W (v7.2) y los árboles filogenéticos de máxima probabilidad se construyeron utilizando el método bootstrap para probar la filogenia en 1000 replicaciones mediante el software MEGA (vX). Se consideraron significativos los valores de Bootstrap mayores o iguales a 80.

Todos los datos se analizaron y representaron gráficamente utilizando Excel (v16.61) y/o GraphPad Prism (v9.4.1). Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism y fueron pruebas t no pareadas, pruebas t pareadas o análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Las correlaciones se realizaron mediante regresión lineal simple. Se consideró significativo P ≤ 0,05. No se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de las muestras, no se excluyeron datos del análisis y se asumió que la distribución de los datos era normal, pero esto no se probó formalmente. Finalmente, los investigadores no estaban cegados a la asignación durante los experimentos y la evaluación de resultados.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos de secuenciación de este estudio se han depositado en NCBI (números de acceso OQ417114 a OQ417135). Los datos de origen se proporcionan con este documento en formato Excel.

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Agradecemos a todos los participantes sin los cuales este trabajo no sería posible, al Laboratorio de Retrovirus de la Facultad de Medicina de Johns Hopkins por su asistencia técnica y orientación, y a F. Simonetti por su cuidadosa revisión y sus conocimientos sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones NIH P01AI131306 (JEC), R01AI127142 (LG/JEC), R01DA050529 (JEC), R01MH127981 (RTV), R01AI140789 (JNB) y R01MH113512-03S1 (LHR). El Centro de Nuevas Terapéuticas para los Trastornos Cognitivos Asociados al VIH de la Universidad Johns Hopkins proporcionó financiación piloto adicional a RTV (P30MH075673). Esta investigación fue facilitada por la infraestructura y los recursos proporcionados por el Centro de Investigación del SIDA de la Universidad Johns Hopkins, un programa financiado por los NIH (P30AI094189). El PAGC fue financiado en parte por la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Finanzas 001 y el Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq (Proc. 141953/2019-5). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Estos autores contribuyeron igualmente: Rebecca T. Veenhuis, Celina M. Abreu.

Departamento de Patobiología Molecular y Comparada, Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MD, EE. UU.

Rebecca T. Veenhuis, Celina M. Abreu, Pedro AG Costa, Edna A. Ferreira, Janaysha Ratliff, Lily Pohlenz, Erin N. Shirk, Leah H. Rubin, Joel N. Blankson, Lucio Gama y Janice E. Clements

Departamento de Neurología, Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MD, EE. UU.

Rebecca T. Veenhuis, Leah H. Rubin y Janice E. Clements

Departamento de Epidemiología, Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MD, EE. UU.

Leah Rubin

Departamento de Psiquiatría y Ciencias del Comportamiento, Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MD, EE. UU.

Leah Rubin

Departamento de Medicina, Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MD, EE. UU.

Joel N. Blankson

Centro de Investigación de Vacunas, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID), Institutos Nacionales de Salud (NIH), Bethesda, MD, EE. UU.

Lucio Gama

Departamento de Patología, Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MD, EE. UU.

Janice E. Clemente

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RTV, CMA, LHR, JNB, LG y JEC diseñaron experimentos. RTV, CMA, PAGC, EAF, JR, LP y ENS realizaron experimentos. RTV, CMA, JNB, LG y JEC analizaron los datos. LHR y JNB proporcionaron materiales. RTV, JNB y JEC escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Janice E. Clements.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Microbiology agradece a Jeremy Luban, Philippe Benaroch y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Se evaluaron las líneas celulares MT-4, CEMx174 y MOLT4-CCR5 para determinar la expresión del receptor de entrada del VIH CCR5, CXCR4 y CD4. Las células se clasificaron en singletes y luego en células vivas, el histograma sombreado son células sin teñir, marcador de línea negra de interés.

Sangre completa (A), PBMC (B) y monocitos seleccionados negativamente (C) de un sujeto representativo se utilizan para mostrar que la selección negativa da como resultado una menor contaminación por CD4 en las células sembradas y porcentajes de subconjuntos de monocitos similares. Las células se activan primero por la expresión de TLR2, los monocitos (TLR2+) se activan además por la expresión de CD14 y CD16, clásica (CD14 + CD16−), intermedia (CD14 + CD16+) y no clásica (CD14-CD16+). Los linfocitos (TLR2-) son puertas basadas en la expresión de CD3 y CD4, células T CD4 (CD3 + CD4+).

Se utilizaron sobrenadantes de cultivo de pocillos QVOA para CD4 y MDM positivos para CP11 (A), CP21 (B), CP25 (C) y CP36 (D) para infectar células MT-4 y se evaluó la cinética viral midiendo el ARN del VIH en el sobrenadante con el tiempo.

Datos fuente

Se usó CP25 CD4-A1 (m) como secuencia maestra para comparar las otras secuencias de CP25-CD4 y 2 secuencias representativas de CP36 CD4 y MDM con CP25 MDM-A2 (amarillo).

Secuencias Nef de pocillos positivos de MDM y CD4 QVOA.

Las muestras posteriores a la activación singlete se controlan en TLR2 y se dispersan lateralmente para separar los monocitos (TLR2+) de los linfocitos (TLR2-) (A). Luego, las células TLR2+ se clasifican en subconjuntos de monocitos, clásico (CD14 + CD16−), intermedio (CD14 + CD16+) y no clásico (CD14lo/-CD16+) (B). Las células TLR2 se separan según la expresión de CD3 y CD159a (C) y luego se controlan aún más la expresión de CD4 y CD8 (D). Las células T CD4 están cerradas como (TLR2-CD3 + CD4 + CD8−). (E) MDM con y sin activación durante 12 días con PMA se retiraron de la placa con TrypLE y se tiñeron con Live/Dead Near IR y con o sin CD3 durante 30 minutos a 4C. Las células se permeabilizaron utilizando Biolegend PermFast y se tiñeron con CD68 o control de IgG compatible. Las células se procesaron inmediatamente en un BD LSRFortessa. Primero se cerraron las células para eliminar los desechos, luego para eliminar los dobletes y, finalmente, para eliminar las células muertas.

Tablas complementarias 1 a 3.

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Reimpresiones y permisos

Veenhuis, RT, Abreu, CM, Costa, PAG et al. Los macrófagos derivados de monocitos contienen reservorios de VIH latentes persistentes. Nat Microbiol 8, 833–844 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01349-3

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Recibido: 26 de abril de 2022

Aceptado: 01 de marzo de 2023

Publicado: 27 de marzo de 2023

Fecha de emisión: mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01349-3

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