Sinergia y adaptación al oxígeno para el desarrollo del próximo

Naturaleza (2023)Cita este artículo

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La microbiota intestinal humana ha ganado interés como factor ambiental que puede contribuir a la salud o la enfermedad1. El desarrollo de probióticos de próxima generación es una estrategia prometedora para modular la microbiota intestinal y mejorar la salud humana; sin embargo, varios candidatos clave a los probióticos de próxima generación son estrictamente anaeróbicos2 y pueden requerir sinergia con otras bacterias para un crecimiento óptimo. Faecalibacterium prausnitzii es una bacteria intestinal altamente prevalente y abundante asociada con la salud humana, pero aún no se ha desarrollado en formulaciones probióticas2. Aquí describimos el aislamiento conjunto de F. prausnitzii y Desulfovibrio piger, una bacteria reductora de sulfato, y su alimentación cruzada para el crecimiento y la producción de butirato. Para producir una formulación probiótica de próxima generación, adaptamos F. prausnitzii para tolerar la exposición al oxígeno y, en estudios de prueba de concepto, demostramos que el producto simbiótico es tolerado por ratones y humanos (identificador de ClinicalTrials.gov: NCT03728868) y se detecta en el intestino humano en un subconjunto de participantes del estudio. Nuestro estudio describe una tecnología para la producción de probióticos de próxima generación basada en la adaptación de bacterias estrictamente anaeróbicas para tolerar la exposición al oxígeno sin una reducción de las posibles propiedades beneficiosas. Nuestra tecnología puede utilizarse para el desarrollo de otras cepas estrictamente anaeróbicas como probióticos de próxima generación.

La microbiota intestinal humana adulta consta de al menos tantas células bacterianas como nuestro número total de células somáticas y germinales3 y sus genomas colectivos (microbioma) contienen más de 500 veces más genes que nuestro genoma humano4. La metagenómica comparada ha revelado que, en comparación con el microbioma de pacientes con diabetes tipo 25,6,7, hiperlipidemia8 y enfermedad inflamatoria intestinal9,10, un microbioma sano se asocia frecuentemente con una mayor diversidad microbiana y una mayor abundancia de bacterias productoras de butirato. como Faecalibacterium prausnitzii. En particular, F. prausnitzii es una especie clave cuya abundancia varía con la edad y el estilo de vida, y está relativamente agotada en la microbiota intestinal de las personas que viven en el mundo occidental11.

Los microorganismos intestinales humanos no actúan de forma aislada sino que forman interacciones ecológicas complejas que son importantes para la homeostasis intestinal. Un atributo clave de la microbiota intestinal es la fermentación de carbohidratos a ácidos grasos de cadena corta (AGCC), incluido el butirato, que se asocia con varios beneficios para el huésped12. La fermentación es el principal proceso de generación de energía utilizado por los microorganismos intestinales, y la eliminación de los subproductos del sumidero de electrones de la fermentación, como el lactato y el hidrógeno, es esencial para mantener los procesos fermentativos13. En consecuencia, los captadores de hidrógeno, como los metanógenos y las bacterias reductoras de sulfato, son importantes para establecer redes metabólicas intestinales14.

Aquí informamos el aislamiento de una nueva cepa de F. prausnitzii en cocultivo con una nueva cepa del reductor de sulfato Desulfovibrio piger. Describimos el desarrollo de una tecnología para la producción de F. prausnitzii como probiótico de próxima generación y evaluamos su seguridad para el consumo humano.

Para preservar las interacciones entre microorganismos y aislar bacterias que puedan servir como sumidero de electrones y eliminar el lactato, colocamos material fecal de un individuo sano directamente en placas de agar con medio de Postgate (PGM) en condiciones anaeróbicas (Métodos). En estas condiciones, aislamos una cepa de F. prausnitzii (DSM32186) que creció en PGM como cocultivo con una cepa de D. piger (DSM 32187) (Fig. 1a, b). D. piger son bacilos gramnegativos anaeróbicos obligados, no fermentadores15 y reductores de sulfato prevalentes en el intestino humano16, no se encuentran de forma aislada fuera del intestino y, por lo tanto, se consideran comensales específicos del intestino17.

a, Cocultivo de F. prausnitzii DSM 32186 y D. piger DSM 32187 en placas de PGM sin suplementación de glucosa o acetato. b, Tinción de Gram de colonias del aislamiento de F. prausnitzii DSM 32186 y D. piger DSM 32187. Las flechas indican F. prausnitzii (bastones fusiformes largos) (1) y D. piger (bastones cortos) (2). Barra de escala, 10 μm. c, Dendrograma que ilustra la relación entre D. piger DSM 32187 y genomas relacionados. d, Dendrograma que ilustra la relación entre F. prausnitzii DSM 32186 y genomas relacionados. e, El número de unidades formadoras de colonias de F. prausnitzii DSM 32186 en monocultivo y en cocultivo con D. piger DSM 32187 en condiciones anaeróbicas en mPGM (PGM que contiene 25 mM de glucosa) durante 24 h. P = 0,0003. f, Perfiles de metabolitos de F. prausnitzii DSM 32186 y D. piger DSM 32187 cultivados como monocultivos o cocultivo en condiciones anaeróbicas en medio mPGM durante 24 h. Glucosa: P = 0,0000031 (F. prausnitzii + D. piger versus D. piger), P = 0,0000038 (F. prausnitzii + D. piger versus F. prausnitzii); lactato: P = 0,0000001 (F. prausnitzii + D. piger versus D. piger), P = 0,0000005 (F. prausnitzii versus D. piger), P = 0,00014 (F. prausnitzii + D. piger versus F. prausnitzii); acetato: P = 0,0000004 (F. prausnitzii + D. piger versus D. piger), P = 0,0000003 (F. prausnitzii versus D. piger); butirato: P = 0,000001 (F. prausnitzii + D. piger versus D. piger), P = 0,0000031 (F. prausnitzii + D. piger versus F. prausnitzii). El 'cambio mM' en el eje y indica la diferencia en la concentración del medio inoculado al inicio. g, Esquema de la alimentación cruzada sugerida entre F. prausnitzii y D. piger como cocultivo en mPGM. n = 3 experimentos independientes, ***P < 0,001 determinado mediante prueba t de dos colas (e) o ANOVA unidireccional (f). Los datos son media ± sem

Para confirmar la identidad de los aislados, secuenciamos sus genomas y observamos que D. piger DSM 32187 se agrupaba con otras cepas secuenciadas de D. piger (Fig. 1c), mientras que F. prausnitzii DSM 32186 se agrupaba con F. prausnitzii filogrupo grupo II. incluida la cepa A2-165 (Fig. 1d). Los análisis genómicos mostraron que ambos aislados formaban clados específicos en el árbol filogenético, lo que indica que representaban cepas no caracterizadas previamente. Dado que A2-165 tiene propiedades antiinflamatorias18 y puede interactuar en la interfaz mucosa19, verificamos el potencial probiótico de DSM 32186 evaluando sus propiedades inmunomoduladoras en comparación con A2-165. Observamos reducciones similares de la secreción de IL-8 inducida por interleucina-1β (IL-1β) cuando se aplicaron sobrenadantes de las diferentes cepas de F. prausnitzii a células Caco-2 (Datos ampliados, Fig. 1), lo que confirma la relación con A2- 165 a nivel fenotípico.

Presumimos que el aislamiento conjunto de F. prausnitzii y D. piger en PGM y su supuesta relación simbiótica resultó de requisitos metabólicos complementarios. Para verificar esta hipótesis, cocultivamos las dos cepas en un medio PGM modificado que contenía glucosa para soportar F. prausnitzii, y observamos que el crecimiento de F. prausnitzii aumentó significativamente en el cocultivo en comparación con el monocultivo en el mismo medio ( Figura 1e). El análisis de metabolitos en medio condicionado después de 24 h de crecimiento reveló que, como se esperaba, los monocultivos de D. piger consumieron lactato y produjeron acetato sin consumir glucosa, mientras que los monocultivos de F. prausnitzii produjeron cantidades muy pequeñas de lactato (Fig. 1f). Sin embargo, los cocultivos de F. prausnitzii con D. piger promovieron la fermentación de glucosa y la producción de lactato y butirato (Fig. 1f). F. prausnitzii produce butirato a través de la vía butiril-coenzima A (CoA): acetato CoA-transferasa y, en consecuencia, el acetato no se acumuló en el medio en los cocultivos (Fig. 1f), ya que se requiere acetato para la producción de butirato20,21. Por lo tanto, nuestros hallazgos sugieren que D. piger funcionó como un sumidero de electrones en el cocultivo en PGM mientras consumía lactato; D. piger generó acetato que fue utilizado por F. prausnitzii para el crecimiento y la producción de butirato (Fig. 1g).

El desarrollo de productos para probióticos de próxima generación es un desafío debido a la sensibilidad al oxígeno de las bacterias intestinales humanas. Este proceso también requiere la optimización de las condiciones de crecimiento para obtener rendimientos de biomasa suficientes, así como estrategias novedosas para preservar la viabilidad del producto final2. Utilizamos el cocultivo de F. prausnitzii con D. piger para aumentar el rendimiento del crecimiento en las fermentaciones como se muestra en la Fig. 1e. Sin embargo, como F. ​​prausnitzii es extremadamente sensible al oxígeno en el aire ambiente21, no se recuperaron colonias cuando F. prausnitzii DSM 32186 se expuso al aire durante 20 minutos (Fig. 2a). Por el contrario, D. piger es relativamente tolerante al oxígeno en las mismas condiciones (Datos ampliados, figura 2).

a, Tolerancia al oxígeno de F. prausnitzii DSM 32186 en medio YCFAG después de la exposición al aire ambiente durante 20 minutos en comparación con placas de control incubadas en anaerobiosis. b, Presentación esquemática del biorreactor modelo intestinal redox humano simulado modificado (m-SHIRM). c, La estrategia de adaptación oxidativa utilizada para desarrollar cepas de F. prausnitzii tolerantes al oxígeno. d, Tolerancia al oxígeno de F. prausnitzii DSM 32379 adaptado al oxígeno desarrollado a partir de la cepa parental DSM 32186. La exposición al oxígeno se realizó como en la Fig. 2a. Los números a la derecha de las placas de agar en a,d indican dilución.

Como se mostró anteriormente, la vida útil de las formulaciones que contienen F. prausnitzii se puede aumentar mediante el uso de antioxidantes como la cisteína, aunque con aplicabilidad limitada para la producción a escala industrial, ya que la viabilidad se pierde después de una exposición de 24 h al aire ambiente22. Para mejorar la tolerancia al oxígeno de F. prausnitzii utilizamos una estrategia de adaptación utilizando un biorreactor m-SHIRM23, en el que DSM 32186 se expuso a condiciones oxidadas durante diez pasos de subcultivo consecutivos, con concentraciones decrecientes de cisteína y potencial anódico creciente (Fig. 2b, c). . En cada paso, se inoculó anaeróbicamente una muestra del paso anterior en medio de crecimiento de glucosa de ácido graso casitona (YCFAG) de extracto de levadura. La inspección visual de las placas reveló distintos morfotipos de colonia en los subcultivos sexto y décimo (Datos ampliados, Fig. 3), y se seleccionaron cinco morfotipos de colonia para la caracterización de la tolerancia al oxígeno después de la confirmación taxonómica como F. ​​prausnitzii mediante la secuenciación del gen 16S rRNA. Se observó claramente una mayor tolerancia al oxígeno para dos morfotipos (Datos ampliados, figura 4a): DSM 32378 (Datos ampliados, figura 4b) y DSM 32379 (Figura 2d), y se produjo sin pérdida de capacidad de producción de butirato (Datos ampliados, figura 4c). ). DSM 32379 tuvo el mayor aumento de tolerancia al oxígeno (Datos ampliados, Fig. 4a) y, por lo tanto, se seleccionó adicionalmente para el análisis del crecimiento sinérgico con D. piger DSM 32187, que tampoco se vio afectado (Datos ampliados, Fig. 5).

Por lo tanto, como resultado de la tolerancia al oxígeno y el cocultivo con D. piger, pudimos producir F. prausnitzii en cantidades suficientes para su administración a humanos: el DSM 32379 tolerante al oxígeno se pudo liofilizar y cumplió las 2 semanas. criterios de estabilidad adecuados a -20 °C para desarrollarse en cápsulas con pérdida limitada de viabilidad (log10 (unidades formadoras de colonias (UFC) g-1) = 9,6 frente a 9,5 antes y después de dos semanas de almacenamiento, respectivamente). Por el contrario, la cepa parental DSM 32186 produjo una menor biomasa (log10(CFU g-1) = 8,5) y sufrió una pérdida de viabilidad del 97%.

Para describir los posibles mecanismos moleculares que conducen a una mayor tolerancia al oxígeno, realizamos la secuenciación del genoma del DSM 32379, que reveló 15 variantes en 10 loci que afectan a 23 nucleótidos (0,0007% del genoma total). Estas variantes se produjeron en genes con funciones conocidas y desconocidas (Tabla de datos ampliados 1), pero como no pudimos modificar genéticamente el DSM 32186 utilizando enfoques de biología molecular, no pudimos verificar su papel en el desarrollo de la tolerancia al oxígeno y, por lo tanto, los mecanismos moleculares siguen siendo desconocidos. . Sin embargo, la tolerancia al oxígeno en DSM 32379 no alteró las propiedades inmunomoduladoras (Datos ampliados, figura 1) y DSM 32379 retuvo la capacidad de explotar un transbordador de electrones extracelular dependiente de riboflavina (Datos ampliados, figura 6) que caracterizamos previamente en F. prausnitzii A2-165 (ref.19). Estos resultados indican que la tolerancia al oxígeno en el DSM 32379 no alteró la fisiología celular, el metabolismo ni el potencial de interactuar con el huésped en la interfaz mucosa, y esta variante fue seleccionada para la producción de un producto en investigación.

A continuación, evaluamos la seguridad del producto combinado administrando ratones macho y hembra Swiss Webster con una suspensión bacteriana que contenía F. prausnitzii DSM 32379 y D. piger DSM 32187. Los ratones recibieron 1010 UFC por cepa y dosis, 5 veces durante la primera semana. y luego dos veces por semana durante 3 semanas, y no observamos respuestas adversas. Los niveles cecales de F. prausnitzii y D. piger se evaluaron mediante PCR cuantitativa (qPCR), pero no observamos niveles elevados para ninguna de las especies al final del estudio, quizás debido al modo y frecuencia de la administración y a la localización colónica. de F. prausnitzii y/o especificidad del huésped.

Para investigar la tolerabilidad de la bacteria, reclutamos a 50 hombres y mujeres sanos de entre 20 y 40 años para un estudio aleatorizado controlado con placebo para la suplementación con niveles bajos (1 × 108–5 × 108 UFC por cápsula) o altos (1 × 109–5 × 109 UFC por cápsula) dosis de F. prausnitzii DSM 32379 y D. piger durante 8 semanas en comparación con placebo (Tabla complementaria 1). Los grupos tenían características clínicas coincidentes con las excepciones de la edad (más alta en el grupo de dosis baja en comparación con el placebo), niveles de alanina transaminasa (más bajos en el grupo de dosis baja en comparación con el placebo) y niveles de fosfatasa alcalina (más bajos en el grupo de dosis alta). grupo comparado con placebo). El producto en investigación fue bien tolerado, independientemente de la dosis. Ningún participante del estudio interrumpió el estudio debido a un evento adverso (Tabla complementaria 2) y no hubo un aumento en la frecuencia de eventos adversos o síntomas gastrointestinales en los grupos de tratamiento (Tablas complementarias 3 y 4). No hubo diferencias clínicamente relevantes o estadísticamente significativas entre grupos en el cambio entre el inicio y las ocho semanas en ningún criterio de valoración secundario de la bioquímica sanguínea (incluida la función renal, el recuento de células sanguíneas, las enzimas hepáticas, los marcadores de inflamación, la hemoglobina, la hemoglobina glicosilada o el ayuno). glucosa en sangre; tablas complementarias 5 y 6).

Realizamos una secuenciación metagenómica de todo el genoma para evaluar posibles efectos sobre la microbiota intestinal humana. No hubo diferencias entre grupos en la composición general al inicio o al final de la administración (Datos ampliados, Fig. 7a, b), y no se observó ningún cambio en ninguno de los grupos en comparación con el valor inicial (Datos ampliados, Fig. 7c). -mi). Sin embargo, el número de lecturas de secuenciación para D. piger evaluadas a nivel de especie aumentó en los participantes que recibieron la dosis alta (P <0,01) (Fig. 3a), mientras que las lecturas para F. prausnitzii a nivel de especie no cambiaron (Fig. 3b ). Utilizamos la captura del genoma para cuantificar específicamente las cepas y observamos que tanto F. prausnitzii DSM 32186 como D. piger DSM 32187 parentales tenían una alta prevalencia al inicio del estudio (43 de 43 y 35 de 43, respectivamente). De acuerdo con los resultados a nivel de especie, las proporciones de D. piger DSM 32187 aumentaron en el grupo de dosis alta (P = 0,051; Fig. 3c), y particularmente en aquellos con baja abundancia relativa al inicio (menos del 0,05%, P = 0,042; Datos ampliados, figura 8), aunque se mantuvo dentro del rango observado para el grupo de placebo (figura 3c) y para suecos sanos muestreados varias veces durante un año16. También encontramos que las proporciones de F. prausnitzii DSM 32186 no cambiaron (Fig. 3d). De acuerdo con la falta de cambios en la composición, los niveles de AGCC fecales no cambiaron (Tabla complementaria 7) y, a pesar del aumento en D. piger, no hubo cambios en los niveles de sulfuro de hidrógeno fecal (Datos ampliados, figura 9). Estos resultados sugieren que nuestra formulación probiótica es segura tanto para el huésped (es decir, falta de eventos adversos y síntomas gastrointestinales) como para la microbiota intestinal (es decir, falta de cambios metabólicos y de composición).

a,b, Recuentos fecales totales de D. piger (P = 0,033) (dosis alta) (a) y F. prausnitzii (b) en datos metagenómicos antes y después de la administración del producto en investigación. c, d, La abundancia relativa de D. piger DSM 32187 (c) y F. prausnitzii DSM 32186 (d) en datos metagenómicos antes y después de la administración. n = 13 (placebo), 16 (dosis baja) y 14 (dosis alta); **P < 0,01, prueba de rangos con signo de Wilcoxon bilateral. Los datos son media ± sem

La abundancia total a nivel de especie de F. prausnitzii osciló entre 3,4 y 25,9% (media 13,2%), que fue similar al rango observado para individuos sanos de edad similar de los EE. UU., así como para individuos sanos de mayor edad de Suecia y el Reino Unido16 , y mayor que la abundancia a nivel de especie en un gran metanálisis reciente que incluye 7.907 metagenomas fecales11 (media 6,5 ​​± 7,6%). Por lo tanto, un mayor aumento de F. prausnitzii probablemente estuvo limitado por la saturación del nicho. Sin embargo, como observamos un aumento para D. piger DSM 32187, sobre la base del modelo de la Fig. 1g, planteamos la hipótesis de que hubo un efecto en la abundancia de otros productores de butirato, como aquellos que requieren acetato extracelular para la producción de butirato. similar a F. prausnitzii20. Cuantificamos genes terminales para la producción de butirato y observamos una correlación positiva significativa para el cambio en el potencial de producción de butirato y el cambio en D. piger DSM 32187 al final de la administración en comparación con el valor inicial en todos los individuos (rho de Spearman = 0,48, P = 0,001 ) y en individuos que recibieron una dosis baja o alta (rho de Spearman = 0,49, P = 0,006), pero no en el grupo de placebo (rho de Spearman = 0,39, P = 0,185). Estos resultados están en línea con un estudio reciente que muestra la coexistencia de Desulfovibrio con diferentes productores de butirato, como Faecalibacterium, Roseburia, Oscillospira y Coprococcus24, y sugieren que nuestra formulación probiótica podría respaldar el potencial general de producción de butirato en comunidades complejas dentro del intestino humano. . Estos resultados también resaltan la importancia potencial de las configuraciones de la microbiota intestinal basales y/o específicas para las estrategias de tratamiento basadas en la microbiota25,26,27,28.

Finalmente, intentamos detectar F. prausnitzii DSM 32379 en muestras fecales. Los ensayos de qPCR dirigidos a una o más de las variantes genéticas no fueron suficientemente discriminativos y los métodos de captura del genoma no pudieron usarse para diferenciar la variante tolerante al oxígeno DSM 32379 del DSM 32186 parental, ya que estos métodos requieren menos del 96% de similitud del genoma completo. para identificar cepas únicas29, y el DSM 32379 es 99,9993% idéntico al DSM 32186. Por lo tanto, los recuentos de F. prausnitzii DSM 32186 detectados por captura del genoma al final de la administración probablemente representan la suma del DSM 32186 endógeno y del oxígeno- tolerante DSM 32379 administrado con la formulación probiótica. Para rastrear la posible presencia de DSM 32379 en muestras fecales, detectamos las variantes genéticas específicas en los datos metagenómicos (Métodos). Observamos pocas variantes de marcadores (por ejemplo, variante 7) en algunos participantes al inicio del estudio o en el grupo de placebo, en línea con la plasticidad genética observada de F. prausnitzii10, y encontramos variantes adicionales y/o varias combinaciones al final del estudio. administración en un subconjunto de los participantes del estudio en los grupos de dosis baja y dosis alta (Tabla complementaria 8). La baja detección de DSM 32379 en los metagenomas fecales podría deberse a la alta identidad genómica entre DSM 32379 y la cepa parental y la consiguiente cobertura insuficiente en los datos metagenómicos, y podría estar influenciada por los altos niveles de DSM 32186 al inicio del estudio, lo que indica una saturación. nicho en la luz intestinal. Sin embargo, como F. ​​prausnitzii también está presente en la interfaz mucosa19, el muestreo fecal podría no reflejar los recuentos de DSM 32379 cerca de la mucosa, donde el DSM 32379 tolerante al oxígeno podría tener una ventaja competitiva. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que nuestro probiótico de próxima generación podría aumentar la presencia de F. prausnitzii en grupos de pacientes con menor abundancia de esta bacteria (como aquellos con diabetes tipo 2) y en individuos con inflamación intestinal (como enfermedad inflamatoria intestinal). como lo respalda la observación de que la administración de F. prausnitzii A2-165 mejora la colitis y es capaz de restaurar parcialmente la microbiota en ratones9.

Nuestro estudio tiene algunas limitaciones. No hemos explorado las respuestas transitorias o personalizadas de la microbiota intestinal a la formulación administrada debido a datos longitudinales limitados. Además, no pudimos determinar los mecanismos moleculares que conducen a una mayor tolerancia al oxígeno en F. prausnitzii. Sin embargo, hemos desarrollado un enfoque basado en la interacción sintrófica entre F. prausnitzii y D. piger aislados en este estudio, que conduce a un mayor crecimiento de F. prausnitzii y producción de butirato in vitro y podría influir en el potencial de producción de butirato in vivo en el ser humano. intestino.

Dirigirse a la microbiota intestinal tiene un gran potencial para mejorar la salud humana, y los estudios metagenómicos de las últimas dos décadas han identificado una amplia gama de bacterias que podrían ser candidatas para el desarrollo de probióticos de próxima generación2. Sin embargo, como el 70% de las especies bacterianas detectadas en estudios metagenómicos carecen de representantes cultivados30, se han evaluado pocos candidatos potenciales en estudios en humanos. Por ejemplo, se ha descubierto que Akkermansia muciniphila31 y Anaerobutyricum soehngenii25 como especies individuales o en combinación con bacterias formadoras de esporas32 son seguras para el consumo humano y los datos preliminares muestran que tienen efectos positivos sobre el metabolismo de la glucosa en ratones y humanos25,31,32.

Los principales desafíos para el desarrollo de bacterias intestinales humanas como probióticos de próxima generación son el crecimiento exigente (es decir, los requisitos de nutrientes o condiciones específicas) y la sensibilidad al oxígeno. De hecho, los ejemplos de aislados humanos seleccionados como probióticos de próxima generación hasta el momento incluyen cepas de Bacteroides y Clostridium2 (como Bacteroides fragilis y Clostridium butyricum) que tienen una tolerancia relativamente alta al oxígeno entre las bacterias anaeróbicas intestinales33,34. Las bacterias intestinales con tolerancia inherente al oxígeno pueden desarrollar una mayor tolerancia al oxígeno tras la exposición directa al oxígeno, como lo demostraron Meehan et al., quienes aislaron variantes de B. fragilis habilitadas por oxígeno34. Este enfoque no se puede aplicar a bacterias extremadamente sensibles al oxígeno como F. ​​prausnitzii, que, sin embargo, se pueden atacar mediante el enfoque que se describe aquí.

Hasta donde sabemos, bacterias estrictamente anaeróbicas como F. ​​prausnitzii no se habían descrito en formulaciones vivas para consumo humano. Dado que la abundancia de F. prausnitzii se reduce en pacientes con hiperlipidemia8, prediabetes y diabetes tipo 25,6, enfermedad del hígado graso no alcohólico35 y enfermedad inflamatoria intestinal9, la producción de F. prausnitzii como probiótico de próxima generación es de gran interés. Nuestra estrategia basada en la explotación de las sinergias existentes entre los microorganismos intestinales y la mejora de la tolerancia al oxígeno muestra cómo F. ​​prausnitzii podría desarrollarse como un probiótico de próxima generación para el consumo humano. Esta tecnología se puede utilizar para el desarrollo de otras bacterias extremadamente sensibles al oxígeno como probióticos de próxima generación para dirigirse a poblaciones de pacientes con cantidades reducidas de estas bacterias.

Se inocularon diez microgramos de muestra fecal fresca de un donante varón sano, de 36 años de edad, que no había recibido antibióticos en los 6 meses anteriores, directamente en placas de agar PGM y se incubaron en condiciones anaeróbicas (5% H2, 10% CO2 y N2 molido). gas) a 37 °C en una cámara Coy (Coy Laboratory Products). PGM es un medio de crecimiento ampliamente utilizado para el aislamiento de bacterias reductoras de sulfato.

Se utilizaron técnicas microbiológicas clásicas para obtener cultivos puros. Después de subcultivos consecutivos, se seleccionaron colonias aleatorias y se sometieron a tinción de Gram. Se observaron presuntos tipos de células de F. prausnitzii y D. piger. Después de subcultivos repetidos en medios YCFAG y PGM, que favorecen el crecimiento de F. prausnitzii y D. piger, respectivamente, se obtuvieron cultivos puros de F. prausnitzii y D. piger y los aislados se identificaron mediante secuenciación del gen 16S rRNA de longitud completa. Los aislados se depositaron en virtud del Tratado de Budapest en el Instituto Leibniz DSMZ-Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares GmbH y se incluyeron en la colección como F. ​​prausnitzii DSM 32186 y D. piger DSM 32187.

F. prausnitzii, cepa DSM 32186, se mantuvo de forma rutinaria en condiciones estrictamente anaeróbicas en una cámara anaeróbica Coy. El medio de cultivo de rutina fue YCFAG, que contenía: 2,5 g l-1 de extracto de levadura, 10 g l-1 de casitona, 4,5 g l-1 de glucosa, 0,9 g l-1 de cloruro de sodio, 0,45 g l-1 de fosfato dipotásico, 0,45 g l-1 de dihidrogenofosfato de potasio, 1,32 g l-1 de sulfato de amonio, 4 g l-1 de bicarbonato de sodio, 1 g l-1 de cisteína, 0,001 g l-1 de resazurina, 0,01 g l-1 de hemina, 100 µg l-1 de biotina, 100 µg l-1 de cobalamina, 300 µg l-1 1 ácido p-aminobenzoico, 500 µg l-1 de ácido fólico y 1.500 µg l-1 de piridoxamina. Todos los componentes se añadieron asépticamente mientras los tubos se lavaban con CO2. El medio se esterilizó en autoclave a 100 kPa a 121 °C durante 15 min. Finalmente, se agregaron tiamina y riboflavina a través de un filtro de 0,22 µm hasta concentraciones finales de 0,05 µg ml-1. Las concentraciones finales de SCFA en el medio fueron 33 mM de acetato, 9 mM de propionato y 1 mM de isobutirato, isovalerato y valerato.

D. piger DSM 32187 se mantuvo en PGM. PGM contiene: 0,5 g l-1 de fosfato dipotásico, 1 g l-1 de cloruro de amonio: 3,5 g l-1 de lactato de sodio, 1 g l-1 de extracto de levadura, 0,1 g l-1 de ascorbato, 0,5 g l-1 de cisteína, 1 g l-1 de sodio cloruro, 10 g l-1 peptona, 1 g l-1 sulfato de sodio, 1 g l-1 cloruro de calcio, 2 g l-1 sulfato de magnesio, 0,5 g l-1 sulfato ferroso, 0,5 g l-1 heptahidrato. El sulfato de sodio, el sulfato de magnesio heptahidratado y el cloruro de calcio se esterilizaron en autoclave por separado, mientras que el sulfato ferroso heptahidrato se esterilizó por filtración con un filtro de 0,22 µm y se añadió después del autoclave y de mezclar todos los componentes. El pH final del medio se ajustó a 7,2 ± 0,2.

Para experimentos de cocultivo, se preparó medio PGM modificado (mPGM) agregando 25 mM de glucosa a PGM.

Para aumentar la tolerancia al oxígeno en F. prausnitzii DSM 32186, se utilizó un biorreactor hecho a medida (m-SHIRM) (Fig. 2b). En una cámara anaeróbica de Coy, se preparó un inóculo inoculando una única colonia bacteriana en 7 ml de YCFAG. Después de 16 h de incubación a 37 °C (densidad óptica a 600 nm (OD600) ≈ 0,7), se inocularon 2,5 ml de este precultivo en la cámara anódica del biorreactor m-SHIRM que contenía 250 ml de YCFAG. Los potenciales de oxidación eléctricos aplicados se mantuvieron mediante voltaje externo en un ánodo de grafito (8,5 cm x 0,25 cm x 2,5 cm) mediante un potenciostato (CHI, 660C). El biorreactor m-SHIRM se mantuvo a 37 °C y se purgó durante 15 minutos con nitrógeno gaseoso antes de la inoculación. Después de 24 h (DO600 ≈ 0,7), se reinocularon 2,5 ml del cultivo bacteriano en otro biorreactor m-SHIRM con las mismas condiciones de crecimiento, excepto por los cambios en el potencial anódico y las concentraciones de cisteína/cistina. Este procedimiento se repitió diez veces con un potencial anódico creciente y una relación cisteína/cistina decreciente (como se describe gráficamente en la Fig. 2c).

Durante los pasos de subcultivo presentados en la Fig. 2c, se recogieron alícuotas de 100 µl y se diluyeron en serie en 900 µl de solución salina tampón fosfato (PBS). Se inocularon alícuotas de 50 µl de cada dilución en YCFAG y se incubaron anaeróbicamente durante 72 h. Después de la incubación, se evaluaron los recuentos viables. Según el morfotipo diferencial de la colonia, las colonias se seleccionaron (Datos ampliados, figura 3) y se conservaron como reservas de glicerol (YCFAG que contiene 20% de glicerol) a -80 °C. Se comprobó la pureza de las variantes adaptadas al oxígeno mediante tinción de Gram.

La tolerancia al oxígeno de F. prausnitzii DSM 32186 y sus variantes se evaluó en YCFAG y en medio PGM para D. piger DSM 32187. Las cepas se precultivaron anaeróbicamente en medio caldo durante 14 h. Después del cultivo, se prepararon anaeróbicamente diluciones en serie diez veces mayores y se inocularon 100 µl de cada dilución en dos conjuntos de cada medio de agar YCFAG o PGM. Las placas incubadas en condiciones anaeróbicas sirvieron como control de viabilidad para las placas expuestas al aire ambiente durante 20 min, las cuales se utilizaron para determinar la tolerancia al oxígeno. La difusión de oxígeno se confirmó mediante la oxidación del colorante resazurina presente en el medio YCFAG. Después de la exposición al aire ambiente, las placas se incubaron anaeróbicamente en una cámara Coy durante 72 h antes de contar las UFC.

La glucosa, los SCFA y el lactato se midieron mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con detección del índice de refracción. Se inyectaron veinte microlitros de caldo de cultivo centrifugado y esterilizado por filtración en una columna Reprogel H de 9 µm (250 × 4,6 mm) con una columna protectora. Autoinyector Jasco AS-2507 plus. Las muestras se enfriaron a 4 °C y se usó ácido sulfúrico 0,0025 M como eluyente a un caudal de 400 µl min-1 con una bomba UltiMate 3000 de Dionex. Los picos se detectaron con el detector Bischoff 8020 RI.

Como se describió anteriormente, F. prausnitzii puede explotar la riboflavina para la transferencia de electrones extracelulares al ánodo en una celda de combustible microbiana19. Se inocularon placas de agar YCFAG con F. prausnitzii DSM 32186 y DSM 32379 a partir de reservas de glicerol congeladas mantenidas a -80 °C y se incubaron anaeróbicamente (5% H2, 10% CO2 y N2) a 37 °C en una cámara Coy (Coy Laboratory Products). ). Se inocularon colonias individuales en 6 ml de caldo YCFAG y se incubaron durante la noche en forma anaeróbica, a 37 °C. Cuando los cultivos alcanzaron una DO600 de ~0,9, las células se recogieron mediante centrifugación a 4000 rpm durante 20 minutos. El sedimento celular se resuspendió en 200 µl de anolito y se inyectó en la cámara anódica. Las células se incubaron durante 5 minutos antes de desafiarlas con riboflavina 200 µM como mediador electrónico.

La pila de combustible microbiana de dos cámaras hecha a medida se ensambló como se describió anteriormente con algunas modificaciones36. El volumen del lecho de las cámaras catódica y anódica fue de 9 ml y el volumen de trabajo fue de 6 ml. Las dos cámaras estaban separadas por un tabique de 1,8 cm de diámetro de una membrana de intercambio catiónico CMI-7000S (Membranes International). Como cátodo y ánodo se utilizaron placas de grafito de dimensiones 2 cm x 1 cm x 0,2 cm. La distancia entre los dos electrodos fue de 10 cm. Los electrodos se conectaron al circuito externo con cables de cobre aislados y el circuito se cerró mediante una resistencia fija de 150 Ω. La cámara anódica contenía tampón fosfato de potasio 50 mM (pH 7,0) como anolito y glucosa 0,1 M. La cámara catódica contenía tampón fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) con ferricianuro de potasio 50 mM como catolito. La celda se mantuvo a 37 °C y las cámaras anódica y catódica se purgaron continuamente con gas nitrógeno y aire, respectivamente. Los datos se registraron utilizando un sistema de adquisición de datos LabJack (LabJack Corporation) en un intervalo de 1 min.

Caco-2 de la Colección Europea de Cultivos Celulares (lote 18H036, Merck) se cultivó en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado (PAA Laboratories) a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2. Las células se incubaron con diferentes fracciones sobrenadantes de F. prausnitzii cultivadas en LYBHI (1:25 y 1:10 en medio DMEM) y se estimularon con (4 ng ml-1 IL-1β) durante 6 h. Los niveles de IL-8 se determinaron por duplicado en sobrenadantes celulares utilizando el kit ELISA DuoSet (R&D Systems). Las células se analizaron periódicamente para detectar infecciones por micoplasmas.

Se alojaron ratones Swiss Webster machos y hembras de 8 semanas de edad con 5 ratones por jaula a una temperatura de 20 ± 1 °C y una humedad del aire de 45 a 70% en condiciones específicas libres de patógenos con una luz de 12 h. :ciclo de oscuridad (luz de 07:00 a 19:00) y fueron alimentados con una dieta de pienso esterilizada en autoclave (LabDiet) y agua ad libitum. A los ratones se les administró un cultivo bacteriano que contenía F. prausnitzii DSM 32379 y D. piger DSM 32187 o un medio/vehículo de glicerol, cinco veces durante la primera semana y luego dos veces por semana durante las siguientes tres semanas. El ADN genómico total se aisló del contenido cecal del ratón como se describió anteriormente y se cuantificó mediante el kit de ensayo de ADN ds Quant-iT PicoGreen (Invitrogen). F. prausnitzii y D. piger se cuantificaron mediante qPCR utilizando los cebadores Fpr-2F (GGAGGAAGAAGGTCTTCGG)/Fprau645-R (AATTCCGCCTACCTCTGCAC)38,39 y DSV691-F (CCGTAGATATCTGGAGGAACATCAG)/DSV826-R (ACATCTAGCATCCATCGTTTACAGC)40. Las observaciones clínicas se realizaron una vez al día. Se monitorearon movimientos clónicos o tónicos, comportamientos estereotipados o anormales. Se controló el peso corporal y el consumo de alimentos. Los exámenes hematológicos realizados incluyeron hematocrito, concentración de hemoglobina, recuento de eritrocitos, recuento total y diferencial de leucocitos y recuento de plaquetas. Los exámenes de bioquímica clínica de las muestras de sangre realizados incluyeron sodio, potasio, urea, colesterol total, nitrógeno ureico en sangre, creatinina, proteínas totales, albúmina total, alanina aminotransferasa, fosfatasa alcalina, gamma glutamil transpeptidasa y ácidos biliares. Se realizó un examen histopatológico del estómago, duodeno, intestino delgado y grueso (incluidas las placas de Peyer), hígado, bazo, timo y ganglios linfáticos mesentéricos. Las observaciones clínicas, el peso corporal, el consumo de alimentos, las evaluaciones del peso de los órganos y las autopsias se realizaron sin enmascaramiento. La hematología sanguínea, la bioquímica clínica y la histopatología fueron evaluadas por personal externo ciego. No se realizó ningún cálculo del tamaño de la muestra ni aleatorización. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de Gotemburgo (Dnr 5.8.18-16056/2019).

El estudio fue un ensayo doble ciego, aleatorizado, controlado con placebo, de un solo centro, de 10 semanas de duración en hombres y mujeres sanos de 20 a 40 años de edad. Los participantes elegibles fueron asignados aleatoriamente para recibir cápsulas una vez al día con una dosis alta (1 × 109 a 5 × 109 UFC por cepa bacteriana; n = 18) o baja (1 × 108 a 5 × 108 UFC; n = 16) de D. piger y F. prausnitzii o placebo (n = 16) durante 8 semanas, seguido de un período de 2 semanas sin suplementación. En total, 16 participantes (dosis alta), 16 (dosis baja) y 14 (placebo) completaron todo el estudio. Ningún participante del estudio interrumpió el estudio debido a un evento adverso. La aleatorización la realizó el patrocinador (Metabogen) mediante sobre sellado (2017, https://www.sealedenvelope.com/simple-randomiser/v1/lists). La aleatorización se estratificó según el sexo. La información sobre el diseño, el análisis y los objetivos del estudio se publicó en Clinicaltrials.gov (NCT03728868) antes del inicio del estudio. El estudio fue aprobado por la Junta Regional de Revisión de Ética de Gotemburgo.

Los voluntarios participantes fueron reclutados a través de publicidad en las redes sociales (por ejemplo, en Facebook e Instagram) y mediante carteles en áreas públicas (por ejemplo, en universidades, hospitales y gimnasios). Los participantes que cumplieron con todos los criterios de inclusión (20 a 40 años de edad, consentimiento informado firmado, sanos sin ninguna enfermedad conocida, disposición y capacidad para participar en visitas planificadas, entrevistas telefónicas y seguir instrucciones, entender sueco hablado y escrito), no tuvieron exclusión alguna. criterios (tratamiento continuo con medicación prescrita, ingesta de suplementos probióticos, tratamiento con antibióticos en los últimos tres meses, embarazo, síntomas del tracto gastrointestinal durante los últimos meses que podrían afectar la participación en el estudio, consumo actual de tabaco, participación en otros estudios clínicos), tuvieron resultados normales. Se invitó a participar a la bioquímica sanguínea, la presión arterial y la frecuencia cardíaca.

El resultado primario fue la tolerabilidad y se probó mediante la interrupción (sí/no) debido al producto en investigación durante 8 semanas de tratamiento. Criterios de valoración secundarios que incluyen el cambio (entre el inicio y las 8 semanas) en la Escala de calificación de síntomas gastrointestinales (GSRS), glucosa en sangre en ayunas, hemoglobina glicosilada (HbA1c), función renal (tasa de filtración glomerular estimada (TFGe) basada en la creatinina sérica), rojo y blanco. recuento de células sanguíneas, alanina transaminasa sérica (ALT), aspartato transaminasa sérica (AST), fosfatasa alcalina sérica (ALP), bilirrubina sérica, proteína C reactiva sérica (PCR), proteína total sérica, niveles de AGCC en heces (butirato, acetato, lactato). , propionato, isovalerato, isobutirato y succinato) se evaluaron entre el inicio y las semanas 4 y 8 (y después de 10 semanas para los SCFA).

Durante la duración del estudio fueron necesarias seis visitas a la clínica del estudio (Medicina Geriátrica, Hospital Universitario Sahlgenska, Mölndal). Los participantes recibieron información sobre el estudio tanto por escrito como verbalmente. Los participantes elegibles sin criterios de exclusión proporcionaron un consentimiento informado firmado antes de cualquier procedimiento de estudio e inscripción. La frecuencia cardíaca y la presión arterial se midieron dos veces en la visita de selección, utilizando un dispositivo Carescape V100 (GE Healthcare). La altura corporal, el peso y las circunferencias de cintura y cadera se midieron con un estadiómetro, así como con una báscula y una cinta métrica. Se extrajo sangre venosa de la vena cubital y se utilizó para análisis de bioquímica sanguínea. Toda la bioquímica de la sangre se analizó dentro de las 4 h posteriores al muestreo en el laboratorio de Química Clínica (Hospital Universitario Sahlgrenska Mölndal). Todas las mujeres también completaron una prueba de embarazo (gonadotropina coriónica humana en orina) que tenía que ser negativa para su inclusión.

En la visita de aleatorización, se recolectaron muestras fecales y se completó GSRS para recopilar información sobre cualquier síntoma gastrointestinal de la semana anterior. Todos los participantes recibieron un diario para registrar las dosis diarias tomadas y tomar notas sobre posibles eventos adversos. Durante las visitas del estudio tres a cinco, se recogieron muestras de heces y sangre, así como datos del formulario del cuestionario GSRS. Dos semanas después de finalizar el tratamiento, se realizó una última visita del estudio para recopilar datos sobre los síntomas gastrointestinales (GSRS) y muestras de heces. Los primeros 15 sujetos aleatorizados fueron contactados por teléfono diariamente durante la primera semana para preguntarles sobre posibles eventos adversos. A partir de entonces, todos los participantes fueron contactados por teléfono una vez a la semana para realizar consultas sobre eventos adversos y recopilar información sobre los síntomas gastrointestinales (GSRS) de la semana anterior.

El producto del estudio se proporcionó en forma de bacterias liofilizadas empaquetadas en cápsulas diseñadas para desintegrarse al llegar al intestino delgado. Se utilizaron cápsulas y excipientes idénticos para el placebo y el producto intervencionista.

La evaluación de los síntomas gastrointestinales de la última semana se realizó mediante el cuestionario GSRS41. GSRS contiene 15 ítems en total y se analizó como una puntuación total que varía de 0 a 45. Los valores 0 a 9 corresponden a ninguno o problemas gastrointestinales mínimos, 10 a 19 corresponden a problemas gastrointestinales mínimos, 20 a 29 corresponden a problemas gastrointestinales moderados, 30 –39 corresponden a problemas gastrointestinales de moderados a graves, y 40 a 45 corresponden a problemas gastrointestinales graves.

Todos los análisis de bioquímica sanguínea se realizaron en el laboratorio de química clínica acreditado por Swedac (número de acreditación 1240) en el Hospital Universitario de Sahlgrenska. La glucosa en sangre se midió utilizando Glucose HK en un instrumento Cobas 6000 (Roche Diagnostics Scandinavia). El coeficiente de varianza (CV) fue del 3% en concentraciones de 5 y 15 mM. La HbA1c se midió mediante HPLC (Mono S, Tricorn 50/50 GL (CDP), columna MonoBeads (GE Healthcare)). Las fracciones de hemoglobina separadas se midieron usando un detector de UV y la absorbancia se cuantificó a 417 nm. El CV fue del 2% en concentraciones de 42 mmol por mol, 63 mmol por mol y 94 mmol por mol. La velocidad de sedimentación globular se midió utilizando el instrumento Starrsed ST, Mechatronics (Triolab). El recuento de eritrocitos (CV: 3% a 2, 4 y 5 × 1012 l-1) se midió utilizando sangre venosa anticoagulada con K2-EDTA y midiendo la absorción de luz. El instrumento utilizado fue el ADVIA 2120i (Siemens Medical Solutions Diagnostics). El recuento de leucocitos se midió utilizando sangre venosa anticoagulada con K2-EDTA y la medición de la absorción de luz, utilizando el instrumento ADVIA 2120i (Siemens Medical Diagnostics AB), con un CV del 7% en concentraciones de 3 × 109 l−1 a 16 × 109l-1. El recuento de trombocitos se midió utilizando sangre venosa anticoagulada con K2-EDTA y medición de la absorción de luz, con un CV del 9% a 80, 200 y 500 × 109 l-1, analizados en un instrumento ADVIA 2120i. ALT cataliza la reacción entre la l-alanina y el 2-oxoglutarato. Una reacción adicional entre el piruvato producido y el NADH genera una medida de oxidación de NADH, que era directamente proporcional a la actividad de ALT, que se midió mediante la disminución de la absorbancia. El CV fue del 6% a 1 µkat l-1 y del 4% a 4 µkat l-1 y el instrumento utilizado fue el Cobas 6000. AST cataliza l-aspartato y 2-oxoglutatrato a oxaloacetato y l-glutamato. La reacción entre oxaloacetato y NADH genera una medida de oxidación de NADH, que fue directamente proporcional a la actividad de AST, que se midió mediante la disminución de la absorbancia. El CV fue del 5% a 1 µkat l-1 y del 3% a 3 µkat l-1 y el instrumento utilizado fue el Cobas 6000. La FA se analizó mediante un ensayo colorimétrico utilizando Cobas 6000 con un CV del 4% a 7 µkat l-1. 1. La bilirrubina total sérica se midió mediante un ensayo colométrico en un sistema Cobas (Roche Diagnostics Scandinavia), con un CV del 5 % en concentraciones de 20 y 130 µM. La creatinina sérica se midió utilizando CREP2 en un instrumento Cobas 6000, con un CV del 4% en concentraciones de 85 y 400 μM. La tasa de filtración glomerular estimada (TFGe) se calculó mediante la fórmula de Lund-Malmö basada en la creatinina sérica, la edad y el sexo42. La proteína total se midió utilizando un Cobas 6000 con un CV del 3% en concentraciones de 50 y 75 g l-1.

Las concentraciones fecales de AGCC acetato, propionato y butirato, así como de succinato y lactato, se determinaron mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (Agilent Technologies) como se describió anteriormente43. En resumen, se transfirieron 100 mg de material fecal congelado a un tubo de 16 × 125 mm equipado con un tapón de rosca y un volumen de 100 µl de solución madre de estándar interno (acetato de [1-13C], propionato de [2H6] 1 M, Se añadió butirato de [13C4] 0,5 M, isobutirato de [1-13C1] e isovalerato de [1-13C] 0,1 M). Antes de la extracción, las muestras se liofilizaron durante la noche. Después de acidificar con 50 µl de HCl al 37%, los ácidos orgánicos se extrajeron dos veces en 2 ml de éter dietílico. Se mezcló una alícuota de 500 µl de la muestra extraída con 50 µl de N-terc-butildimetilsilil-N-metiltrifluoracetamida (Sigma) a 20 °C. Se inyectó un microlitro del material derivado en un cromatógrafo de gases (Agilent Technologies 7890 A) acoplado a un detector de espectrómetro de masas (Agilent Technologies 5975 C). La temperatura se incrementó en un gradiente lineal que consistía en una temperatura inicial de 65 °C durante 6 min, un aumento a 260 °C a 15 °C min-1 y un aumento y mantenimiento de 280 °C durante 5 min. Las temperaturas del inyector y de la línea de transferencia fueron de 250 °C. La cuantificación se completó en el modo de adquisición de monitoreo de iones en comparación con estándares internos etiquetados, con relaciones m/z 117 (ácido acético), 131 (ácido propiónico), 145 (ácido butírico), 146 (ácido isobutírico), 159 (ácido isovalérico). ), 121 (acetato de [2H2,1-13C]), 136 (propionato de [2H5]), 146 (isobutirato de [1-13C1]), 149 (butirato de [13C4]), 160 (isovalerato de [1-13C]).

El poder estadístico se calculó en función de las diferencias anticipadas en las proporciones de sujetos del estudio que interrumpieron el tratamiento debido a eventos adversos. Con una tasa de interrupción de 0,50 frente a 0,05 debido al producto en investigación en los dos grupos de tratamiento frente al grupo de placebo (aleatorizados en 2:1, 32 frente a 16 sujetos), respectivamente, con un nivel alfa de 0,05, utilizando la prueba exacta de Fisher bilateral , se alcanzó una potencia del 88%.

Todos los análisis se realizaron tanto en poblaciones por intención de tratar como por protocolo. La comparación de variables continuas entre los grupos de tratamiento (dosis baja y alta) y placebo se realizó con la prueba de permutación no paramétrica de Fisher y se utilizó la prueba exacta de Fisher (valor de P unilateral más bajo multiplicado por 2) para las variables dicotómicas. El resultado primario fue la tolerabilidad y se probó mediante la interrupción (sí/no) debido al producto en investigación durante 8 semanas de tratamiento. Las diferencias potenciales en las variables de criterio secundario se evaluaron mediante el cambio relativo ajustado por placebo y se compararon con la prueba de permutación no paramétrica de Fisher, que también generó el intervalo de confianza para la diferencia de medias. Todos los análisis se realizaron en casos completos, es decir, no se utilizaron imputaciones. Se consideró significación estadística para valores de P inferiores a 0,05 y todas las estadísticas se realizaron con el software SAS versión 9.4 (SAS Institute). Los intervalos de confianza de los resultados primarios se calcularon utilizando el intervalo de puntuación híbrido de Newcombe44. Los intervalos de confianza basados ​​en permutaciones (tablas complementarias 5 a 8) se calcularon utilizando una macro SAS escrita por el usuario45,46 (//github.com/imbhe/PermTestCI).

El sulfuro de hidrógeno se cuantificó como se describió anteriormente47. Todos los reactivos y tampones se desgasificaron mediante purga con nitrógeno. Las muestras fecales se cortaron y se dividieron en alícuotas (~150 mg) en hielo seco y se mantuvieron congeladas en tubos herméticos de propileno de 2 ml. Luego las muestras se transfirieron a una cámara anaeróbica (COY) y se diluyeron en solución salina tamponada con fosfato. Las suspensiones fecales diluidas se trataron con una solución de acetato de zinc antes de agregar una solución reactiva que consistía en sulfato de N,N-dimetil-p-fenilendiamina. Los tubos se cerraron inmediatamente, se agitaron y se mantuvieron a temperatura ambiente durante 20 minutos y se midió la absorbancia a una longitud de onda de 670 nm. El sulfuro de hidrógeno se midió en muestras fecales de 40 individuos (placebo, n = 12; dosis baja, n = 16; dosis alta, n = 12) que tenían heces tanto al inicio como al final de la administración; no había suficiente material disponible para 1 individuo en el grupo de placebo y 2 en los grupos de dosis alta.

Los participantes recogieron muestras de heces en casa y las almacenaron a temperatura ambiente hasta su entrega a la clínica, donde las muestras se almacenaron a -80 °C. El tiempo máximo entre la toma de muestras y la llegada a la clínica fue de 24 h. Se aisló ADN genómico total de 100 a 150 mg de material fecal utilizando una modificación del protocolo de extracción de ADN IHMS Q48. Las muestras se extrajeron en tubos Lysing Matrix E (MP Biomedicals) que contenían tampón ASL (Qiagen), se agitaron durante 2 minutos y se lisaron mediante dos ciclos de calentamiento a 90 °C durante 10 minutos seguidos de dos ráfagas de perlas a 5,5 m s-1 durante 60 s en un instrumento FastPrep-24 (MP Biomedicals). Después de cada ráfaga de batido de perlas, las muestras se colocaron en hielo durante 5 minutos. Los sobrenadantes se recogieron después de cada ciclo mediante centrifugación a 4 °C. Se agruparon los sobrenadantes de los dos pasos de centrifugación y se purificó una alícuota de 600 µl de cada muestra utilizando el kit QIAamp DNA Mini (QIAGEN) en el instrumento QIAcube (QIAGEN) utilizando el procedimiento para análisis de ADN humano. Las muestras se eluyeron en 200 µl de tampón AE (Tris·Cl 10 mM; EDTA 0,5 mM; pH 9,0). Las bibliotecas para la secuenciación metagenómica de escopeta se prepararon mediante un método sin PCR; La preparación y secuenciación de la biblioteca se realizaron en Novogene (China) en un instrumento NovaSeq (Illumina) con lecturas de extremos emparejados de 150 pb y al menos 6G de datos por muestra.

El ADN genómico total se extrajo de la biomasa microbiana recolectada después de un crecimiento nocturno o en la fase estacionaria. La biomasa obtenida de cultivos líquidos se recogió mediante centrifugación durante 10 minutos a 4500 rpm a 4 ° C y se lavó una vez con PBS para eliminar los contaminantes remanentes.

El ADN para la secuenciación de lecturas cortas de Illumina se extrajo utilizando el kit NucleoSpin Soil (740780.50, Macherey-Nagel) como lo describe el fabricante en presencia de tampón de lisis SL2 y potenciador Sx. Las células se lisaron mediante 2 rondas de batido de perlas a 5,5 m s-1 durante 60 s en un instrumento FastPrep-24 (MP Biomedicals), con incubación en hielo durante 5 minutos entre las dos ráfagas de batido de perlas. La calidad del ADN se evaluó utilizando Tapestation 4200 con Genomic DNA ScreenTape y reactivos (Agilent), y la cuantificación se realizó utilizando el kit de ensayo Quant-iT dsDNA BR (ThermoFisher Scientific). Las bibliotecas para la secuenciación se prepararon utilizando el ultrasonido enfocado Covaris S220 (Covaris), fragmentadas a un tamaño de inserto promedio de 550 pb, y el kit de preparación de bibliotecas sin PCR de ADN TruSeq (20015963 y 20015949, Illumina). Las bibliotecas se cuantificaron utilizando el kit de ensayo Quant-iT dsDNA HS (ThermoFisher Scientific) y se secuenciaron en un instrumento Illumina Miseq utilizando el kit de reactivos MiSeq v3, 600 ciclos.

Se obtuvieron grandes cantidades de ADN de alta calidad para la secuenciación de lecturas largas de Nanopore con una versión modificada del procedimiento Marmur49. Las células se suspendieron en tampón Tris-EDTA (Tris HCl 20 mM, pH 8, EDTA 2 mM) y se lisaron con lisozima (20 mg ml-1) y SDS (2% p/v) en presencia de proteinasa K. El total extraído El ADN se purificó mediante extracción repetida en fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1 v/v) y cloroformo:alcohol isoamílico (24:1 v/v), seguido de precipitación en etanol frío (99,5% v/v). y enrollado del ADN en una varilla de vidrio. El ADN se lavó con etanol al 70% (v/v), se secó a temperatura ambiente y se resuspendió en agua durante la noche a 4 °C. La integridad y la concentración del ADN se evaluaron utilizando Tapestation 4150 con Genomic DNA ScreenTape y reactivos (Agilent) y un fluorómetro Qubit 3.0 y un kit de ensayo Qubit dsDNA BR (ThermoFisher Scientific). El ADN aislado se preparó utilizando el kit de codificación de barras Rapid (SQK-RBK004) siguiendo las instrucciones del fabricante (ONT) y se secuenció en un dispositivo MinION de ONT en una celda de flujo R9.4.1 (FLO-MIN106D). La llamada base se realizó utilizando guppy v. 4.2.2 de ONT.

Los genomas de F. prausnitzii DSM 32186 y DSM 32379 y D. piger DSM 32187 se obtuvieron mediante ensamblaje híbrido de lecturas de Nanopore e Illumina. El pipeline Unicycler v0.4.8 en modo híbrido se utiliza para obtener ensamblajes de novo. Todas las dependencias de Unicycler se instalaron en un entorno conda. Los programas de dependencia incluyen SPAdes v3.13.0, racon v1.4.1, bowtie2 v2.3.5.1 y pilon v1.23. Los ensamblajes híbridos se anotaron utilizando Prokka v1.14.5 (https://github.com/tseemann/prokka).

Para inferir relaciones evolutivas, los genomas de F. prausnitzii y D. piger se alinearon con genomas de alta calidad disponibles públicamente de la misma especie y/o secuencias representativas de clados previamente conocidos, sus vecinos cercanos y grupos externos, respectivamente, utilizando progresivoMauve50. Se utilizaron múltiples alineamientos para reconstruir las filogenias de ambas cepas en MEGA X51. Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el método de máxima verosimilitud compuesta y están en unidades de número de sustituciones de bases por sitio52.

Las lecturas de Illumina se filtraron y recortaron con calidad usando fastq_quality_trimmer del kit de herramientas fastX (https://github.com/lianos/fastx-toolkit/); Las lecturas humanas se eliminaron mapeando las lecturas de alta calidad con el genoma humano (hg19) usando Bowtie2 (ref. 53) (v2.4.4). Después de eliminar las lecturas humanas y de baja calidad (puntuación de calidad <20), obtuvimos lecturas microbianas de extremos emparejados de alta calidad con una profundidad promedio de 45 millones para cada muestra fecal.

Para la captura del genoma, se mapearon lecturas microbianas de alta calidad utilizando Kraken 2 (ref. 54) (v2.1.2) con configuraciones predeterminadas en una base de datos personalizada diseñada agregando los genomas cerrados de las nuevas cepas F. prausnitzii DSM 32186 y D. piger. DSM 32187 a la base de datos RefSeq (versión 107). Las estimaciones de la abundancia de cepas se obtuvieron utilizando Bracken55 (v2.6.2) para lecturas con una longitud mínima de 100 pb.

Se evaluó la composición general de la microbiota intestinal para determinar la abundancia de especies mediante un análisis de coordenadas principales sobre la disimilitud de Bray-Curtis. Las diferencias en la composición se probaron mediante un ANOVA multivariado permutacional utilizando la función adonis2 con 10.000 permutaciones en el paquete vegano en R (https://github.com/vegandevs/vegan/).

Los recuentos de genes en los datos metagenómicos se estimaron utilizando MEDUSA56 con un catálogo de genes que contiene 15.186.403 genes microbianos no redundantes6. El potencial de producción de butirato se cuantificó basándose en cinco genes (but, buk 4hbt y atoA/D) que codifican las enzimas terminales en las cuatro vías intestinales de producción de butirato57. Se utilizaron modelos de Markov de perfil oculto para detectar esos genes en el catálogo de genes, como se describió anteriormente6.

Se detectaron variantes genéticas para F. prausnitzii DSM 32379, tolerante al oxígeno, mapeando las lecturas sin procesar con el genoma ensamblado de la cepa parental DSM 32186 usando snippy v4.4.5 en la configuración predeterminada (https://github.com/tseemann/snippy) . Para detectar las variantes genéticas en los metagenomas fecales, obtuvimos lecturas de F. prausnitzii asignadas al DSM 32379 en cada muestra usando bowtie2 v2.3.5.1, y luego realizamos llamadas de variantes contra el genoma parental DSM 32186 usando snippy v4.4.5. Se consideró que F. prausnitzii DSM 32379 posiblemente se detectó en una muestra solo si: (1) las variantes genéticas de DSM 32379 solo se detectaron al final de la administración; (2) las variantes genéticas que cubren las regiones genómicas relacionadas tenían una abundancia de al menos el 10% de todas las lecturas; y (3) en caso de detección inicial, se deben detectar múltiples variantes al final de la administración con un aumento en todas sus frecuencias en esa muestra fecal (Tabla complementaria 1).

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism v_8.4.3. Se utilizaron pruebas t de Student bilaterales para comparar dos grupos y ANOVA unidireccional con comparación múltiple de Tukey para comparar tres grupos.

Se utilizaron pruebas no paramétricas para comparar la abundancia de especies y cepas en los microbiomas fecales. Se utilizaron pruebas de rangos con signo de Wilcoxon para comparar las abundancias al final de la administración con el valor inicial en muestras coincidentes de un individuo. Se utilizaron pruebas de Kruskal-Wallis para comparar tres grupos.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

La información complementaria sobre la disponibilidad de datos está vinculada a la versión en línea del documento. Los ensamblajes del genoma y los datos de secuencia metagenómica sin procesar se han depositado en el Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA) EMBL-EBI con el número de acceso PRJEB62463. Los datos de secuencia procesados ​​necesarios para el reanálisis están disponibles en GitHub (https://zenodo.org/record/8019851). Los metadatos por tema seudonimizados procesados ​​se proporcionan en las tablas complementarias 2 a 8. Los datos del estudio de seguridad en ratones están disponibles en la Tabla complementaria 9. Si tiene preguntas sobre la cohorte clínica, comuníquese con ML. Las cepas bacterianas son propiedad de Metabogen AB y deben solicitarse a ellos.

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Los autores agradecen a A. Hallén, R. Jakubowicz, L. Olsson, M. Bergentall y S. Håkansson por la asistencia técnica; y H. Imberg por compartir la macro SAS para la prueba de permutación de Fisher-Pitman y el intervalo de confianza. Los cálculos fueron posibles gracias a los recursos de los proyectos SNIC 2020/5-384 y SNIC 2019/8-169 proporcionados por la Infraestructura Nacional Sueca de Computación (SNIC) en UPPMAX, parcialmente financiado por el Consejo Sueco de Investigación a través del acuerdo de subvención no. 2018-05973. Este estudio fue financiado en parte por la Fundación Knut y Alice Wallenberg (2017.0026), el Consejo Sueco de Investigación (2019-01599), el Premio a las Redes Transatlánticas de Excelencia de la Fundación Leducq (17CVD01), los seguros AFA, la Fundación Sueca del Corazón y el Pulmón (20210366), la fundación Novo Nordisk (NNF17OC0028232), subvenciones del estado sueco en virtud del acuerdo entre el gobierno sueco y los consejos provinciales, el acuerdo ALF (ALFGBG-718101) y Metabogen AB. FB es Wallenberg Scholar y Torsten Söderberg Professor de Medicina.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Universidad de Gotemburgo.

Estos autores contribuyeron igualmente: Muhammad Tanweer Khan, Chinmay Dwibedi

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Valentina Tremaroli, Mattias Lorentzon, Fredrik Bäckhed

Laboratorio Wallenberg, Departamento de Medicina Molecular y Clínica, Instituto de Medicina, Universidad de Gotemburgo, Gotemburgo, Suecia

Muhammad Tanweer Khan, Chinmay Dwibedi, Meenakshi Pradhan, Jamie D. Kraft, Robert Caesar, Valentina Tremaroli y Fredrik Bäckhed

Metabogen, Mölndal, Suecia

Muhammad Tanweer Khan

Instituto de Neurociencia y Fisiología, Universidad de Gotemburgo, Gotemburgo, Suecia

Chinmay Dwibedi

Centro de Osteoporosis Sahlgrenska, Departamento de Medicina Interna y Nutrición Clínica, Instituto de Medicina, Universidad de Gotemburgo, Gotemburgo, Suecia

Daniel Sundh y Mattías Lorentzon

Región Västra Götaland, Clínica de Medicina Geriátrica, Hospital Universitario Sahlgrenska Mölndal, Mölndal, Suecia

Matías Lorentzon

Instituto Mary MacKillop de Investigación en Salud, Universidad Católica Australiana, Melbourne, Victoria, Australia

Matías Lorentzon

Departamento de Fisiología Clínica, Hospital Universitario Sahlgrenska, Gotemburgo, Suecia

Fredrik Bäckhed

Centro de la Fundación Novo Nordisk para la Investigación Metabólica Básica, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca

Fredrik Bäckhed

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MTK aisló, caracterizó y adaptó las cepas bacterianas, desarrolló el proceso y desarrolló y produjo la formulación. CD y MP realizaron análisis bioinformáticos. VT procesó muestras para análisis de microbiota e interpretó los resultados con CD y MPJDK caracterizó las propiedades inmunomoduladoras de F. prausnitzii. DS realizó el estudio en humanos. RC realizó el estudio con ratones. ML diseñó y dirigió el estudio de intervención humana. VT, ML y FB supervisaron el proyecto y contribuyeron en partes iguales. MTK y FB conceptualizaron y diseñaron el estudio y escribieron el primer borrador del artículo. Todos los autores analizaron los datos y comentaron el manuscrito.

Correspondencia a Fredrik Bäckhed.

MTK trabaja en parte con Metabogen AB y FB es el fundador de Metabogen AB. Metabogen AB contribuyó con apoyo económico y producto para la intervención humana, pero no participó en el análisis de los datos. FB recibe financiación para investigación de Biogaia AB y forma parte del consejo asesor científico de Bactolife A/S. Los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

Nature agradece a Ruth Ley, Daniel Tancredi y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Modulación de la secreción de IL-8 inducida por IL-1β por células Caco-2 en contacto con sobrenadantes de F. prausnitzii (cepa A2-165 (DSM 17677) incluida como referencia). Las células se expusieron a sobrenadante bacteriano con o sin 4 ng/ml de IL-1β durante 6 horas. Las etiquetas de los grupos del eje horizontal indican la dilución del medio filtrado del cultivo de F. prausnitzii. p = 0,025 (DSM 32186 vs. A2-165, 1/25), p = 0,0000089 (LYBHI vs. A2-165, 1/25), p = 0,00013 (LYBHI vs. DSM32186, 1/25), p = 0,000016 (LYBHI vs. DSM32379, 1/25), p = 0.0000028 (LYBHI vs. A2-165, 1/10), p = 0.000013 (LYBHI vs. DSM32186, 1/10), p = 0.0000039 (LYBHI vs. DSM32379, 1/10). n = 3, ***p < 0,001, *p < 0,05 según lo determinado por ANOVA unidireccional. Los resultados se repitieron en dos experimentos independientes. Los datos se presentan como media ± sem.

Se inocularon diluciones en serie en placas de PGM que se expusieron al aire ambiente durante 20 minutos y se compararon con placas de control incubadas en una cámara anaeróbica de Coy. Los números al lado de las placas de agar indican dilución.

Morfotipo de F. prausnitzii DSM 32379 (flecha b) aislado del biorreactor m-SHIRM durante el décimo paso de subcultivo. La cepa parental F. prausnitzii DSM 32186 se muestra como referencia (flecha a).

a, Cuantificación de la tolerancia al oxígeno de la cepa parental y variantes adaptadas al oxígeno en YCFAG. b, Tolerancia al oxígeno del F. prausnitzii DSM 32378 adaptado al oxígeno. Se inocularon diluciones en serie (que se muestran en la parte superior) en placas YCFAG y se expusieron al aire ambiente durante 20 minutos, y se compararon con placas de control incubadas en anaerobiosis. c, Perfil de metabolitos del DSM 32186 parental y variantes adaptadas al oxígeno cultivadas en medio YCFAG. El cambio en mM en el eje y indica la diferencia con respecto al medio inoculado al inicio.

a, Unidades formadoras de colonias de F. prausnitzii DSM 32186 parental y DSM 32379 tolerante al oxígeno en monocultivo o cocultivo con D. piger DSM 32187 en medio Postgate modificado (es decir, medio Postgate que contiene 25 mM de glucosa; mPGM) después de 24 días h de crecimiento. p = 0,00000073 (DSM 32186), p = 0,00000022 (DSM 32379). b, Perfiles de metabolitos de F. prausnitzii DSM 32379 y D. piger DSM 32187 como monocultivos o cocultivos en mPGM después de 24 h de crecimiento. Glucosa: p = 0,0000008 (F. prausnitzii + D. niñas vs. D. niñas), p = 0,0000012 (F. prausnitzii + D. niñas vs. F. prausnitzii); lactato: p = 0.0000000001 (F. prausnitzii + D. niñas vs. D. niñas), p = 0.0000000013 (F. prausnitzii vs. D. niñas), p = 0.00018 (F. prausnitzii + D. niñas vs. F. prausnitzii ). ); acetato: p = 0,000005 (F. prausnitzii + D. niñas vs. D. niñas), p = 0,0000015 (F. prausnitzii vs. D. niñas), p = 0,012 (F. prausnitzii + D. niñas vs. F. prausnitzii ). ); butirato: p = 0,0000007 (F. prausnitzii + D. niñas vs. D. niñas), p = 0,0000007 (F. prausnitzii + D. niñas vs. F. prausnitzii); El cambio en mM en el eje y indica la diferencia con respecto al medio inoculado al inicio. n = 3 experimentos independientes. ***p < 0,001, *p < 0,05 según lo determinado mediante la prueba t de dos colas (a) o ANOVA unidireccional (b) Los datos se presentan como media ± sem

Después de energizar las células en reposo con glucosa (100 mM), tanto el F. prausnitzii DSM 32186 parental como el DSM 32379 tolerante al oxígeno generaron ondas de corriente mensurables cuando se añadió riboflavina (200 µM), como se describió anteriormente para A2-16519.

Análisis de coordenadas principales para la disimilitud de Bray-Curtis calculado en base a la abundancia de especies para: a, muestras fecales al inicio del estudio (r2 = 0,018; p = 1; adonis); b, muestras fecales al final de la administración (r2 = 0,040; p = 0,660; adonis); c, muestras fecales del grupo placebo al inicio (v2) y al final de la administración (v5) (r2 = 0,009; p = 0,997; adonis); d, muestras fecales del grupo de dosis baja al inicio (v2) y al final de la administración (v5) (r2 = 0,014; p=0,971; adonis); e, muestras fecales del grupo de dosis alta al inicio (v2) y al final de la administración (v5) (r2 = 0,001; p = 0,996; adonis). Las diferencias en la composición se probaron mediante un ANOVA multivariado permutacional utilizando la función adonis2 con 10.000 permutaciones en el paquete vegano en R (https://github.com/vegandevs/vegan/). Se realizaron ajustes para comparaciones múltiples. Los puntos en los gráficos indican muestras fecales de los 43 individuos con datos metagenómicos: placebo, n = 13; dosis baja, n = 16; dosis alta, n = 14. Los análisis no muestran diferencias en la composición de la microbiota entre los grupos al inicio o al final de la administración (paneles a y b, respectivamente), y no hay diferencias al final de la administración en comparación con el inicio en ningún de los grupos (paneles c, d y e).

Cambio en la abundancia relativa en muestras con un valor inicial alto de D. piger DSM 32187 (> 0,05% de la microbiota total; n = 4, p = 0,875, prueba de rangos con signos de Wilcoxon bilateral) y un valor inicial bajo de D.piger DSM 32187 (<0,05 % de la microbiota total; n = 10, p = 0,042, prueba de rangos con signo de Wilcoxon). v2, muestras fecales al inicio del estudio; v5, muestra fecal al final de la administración. Para los diagramas de caja, la línea media es la mediana, las bisagras inferior y superior son el primer y tercer cuartil, los bigotes se extienden desde la bisagra hasta el valor más grande y más pequeño no más de 1,5 × el rango intercuartil (IQR).

El sulfuro de hidrógeno se midió en muestras fecales al inicio y al final de la administración (40 individuos: placebo, n = 12; dosis baja, n = 16; dosis alta, n = 12; no hay suficiente material disponible para 1 individuo en el placebo y 2 en los grupos de dosis alta). Se realizó la prueba de rangos con signos de Wilcoxon bilateral. Los datos se presentan como media ± sem.

Información complementaria que contiene las tablas complementarias 1 a 7, detalles del ensayo e informe estadístico.

Número de lecturas en metagenomas fecales que se asignan a las variantes genéticas que caracterizan a F. prausnitzii DSM 32379, tolerante al oxígeno.

Datos del estudio de seguridad del ratón

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Recibido: 30 de junio de 2021

Aceptado: 27 de junio de 2023

Publicado: 02 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06378-w

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