La elección del cebador del gen 16S rRNA tiene un impacto

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12577 (2023) Citar este artículo

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La secuenciación del amplicón de ARNr 16S o, más recientemente, el análisis metatranscriptómico son actualmente los únicos métodos preferidos para el perfil microbiano de muestras que contienen una proporción predominante de ADN humano y bacteriano. Sin embargo, debido a la amplificación fuera de objetivo del ADN humano, los protocolos actuales son inadecuados para muestras biópticas. Aquí presentamos un método eficiente, confiable y asequible para el análisis de bacteriomas de muestras clínicas donde predomina el contenido de ADN humano. Determinamos el perfil de microbiota en un total de 40 biopsias humanas de esófago, estómago y duodeno mediante secuenciación del amplicón de ARNr 16S con los cebadores ampliamente utilizados 515F-806R (V4) dirigidos a la región V4, cebadores 68F-338R y un conjunto modificado de Cebadores 68F-338R (V1-V2M) dirigidos a la región V1-V2. Con los cebadores V4, en promedio el 70% de las variantes de secuencia de amplicones (ASV) se mapearon en el genoma humano. Por otro lado, esta amplificación fuera del objetivo estuvo ausente cuando se utilizaron los cebadores V1-V2M. Además, los cebadores V1-V2M proporcionaron una riqueza taxonómica y una reproducibilidad del análisis significativamente mayores en comparación con los cebadores V4. Concluimos que el método de secuenciación de ARNr 16S V1-V2M es confiable, rentable y aplicable para muestras humanas abundantes y con bajo contenido de bacterias en la investigación médica.

Durante la última década, la investigación del bacterioma humano utilizando métodos de secuenciación de alto rendimiento independientes del cultivo se ha convertido en una de las técnicas más utilizadas para estudiar comunidades bacterianas que habitan en una amplia variedad de nichos del cuerpo humano1,2. El acceso a tecnologías de tercera generación, junto con los costos decrecientes asociados con la secuenciación de alto rendimiento, ha resultado en un cambio de la secuenciación del gen amplicón 16S rRNA hacia la secuenciación del gen 16S rRNA completo y la secuenciación metagenómica/metatranscriptómica en muestras como heces, vagina humana3 o hisopos de la piel o la cavidad bucal4 que contienen una proporción predominante de ADN humano y bacteriano. Sin embargo, en muestras con bajas concentraciones de ADN bacteriano o aquellas "contaminadas" por el ADN del huésped, como muestras de sangre, orina o biopsias humanas, el perfil del bacterioma todavía depende en gran medida de la secuenciación del gen 16S rRNA. Dado que la cantidad de datos generados es relativamente pequeña, no requiere análisis bioinformáticos complejos5 y el precio también es más asequible. Por otro lado, los resultados de la secuenciación del amplicón 16S rRNA dependen críticamente de la elección de subregiones hipervariables de las nueve regiones variables disponibles intercaladas a lo largo de la secuencia del gen 16S rRNA altamente conservada, así como de la calidad de la información recuperada, así como de la información taxonómica. La precisión puede variar significativamente dependiendo del conjunto de cebadores empleados6. Actualmente, la gran mayoría de los estudios se centran en la región variable única V4, como en el protocolo estandarizado ampliamente adoptado del Proyecto Microbioma Terrestre (EMP)7 o en las regiones variables V1-V38 o V3-V59, como en el protocolo de indexación dual del Microbioma Humano. Proyecto (HMP). Esto se debe principalmente a que la plataforma de secuenciación Illumina, ampliamente utilizada, produce solo secuencias cortas (NextSeq, MiniSeq, iSeq ≤ 300 bases y MiSeq ≤ 600 bases). Desafortunadamente, estudios recientes han demostrado repetidamente que la subregión V4 del gen 16S rRNA, comúnmente objetivo, evalúa los taxones comúnmente presentes en el cuerpo humano con menor precisión6,10,11. Además, junto con la región V3-V5, es particularmente susceptible a la amplificación fuera del objetivo del ADN humano12, especialmente en muestras de biopsia, lo que resulta en la pérdida potencial de taxones raros y resolución bacteriana, por lo que una proporción significativa de datos se desperdicia.

Aquí demostramos un nuevo protocolo que utiliza un conjunto de cebadores dirigidos a la subregión del gen V1-V2 16S rRNA que disminuye drásticamente la amplificación fuera del objetivo del ADN humano en muestras de biopsia del esófago, el estómago y el duodeno, al tiempo que aumenta significativamente la diversidad alfa y la taxonómica. precisión en comparación con los cebadores comúnmente utilizados dirigidos a la región V4. Los cebadores de amplificación para la región V1-V2, incluidas las funcionalidades necesarias para la secuenciación (índices y adaptadores de celda de flujo), se optimizaron para la plataforma Illumina MiniSeq con una longitud de lectura máxima de 150 pb, lo que ofrece una opción rentable para cualquier laboratorio interesado en realizar Secuenciación del gen 16S rRNA de alto rendimiento. Para aumentar aún más el rendimiento de las clasificaciones taxonómicas, incluimos la concatenación de lecturas de pares en el proceso bioinformático13.

El protocolo estandarizado ampliamente utilizado para la secuenciación del amplicón del gen 16S rRNA7,14 resultó ser inadecuado debido a la robusta amplificación fuera del objetivo del ADN humano durante el análisis del bacterioma en muestras de diferentes sitios de biopsia del tracto gastrointestinal (GI) superior. En muestras de los tres tipos de sitios de biopsia (esófago, estómago y duodeno), un promedio del 70% de las variantes de secuencia de amplicones (ASV) se alinearon con el genoma humano, y en algunas muestras llegó hasta el 98% (Fig. 1A). Esto dio lugar a que una parte importante de los datos de secuenciación del análisis del gen 16S rRNA tuvieran que abandonarse debido a una clasificación taxonómica incorrecta. Curiosamente, en las muestras de adenocarcinoma de esófago (EAC), solo alrededor del 20 % de los ASV se alinearon con el genoma humano (Fig. 1), lo que sugiere una representación bacteriana diferente en el entorno del tumor, como se ha observado antes15. El ASV más prevalente identificado según BLAST fue el haplogrupo de mitocondrias de Homo sapiens con un valor E de 6e-83 y 100% de identidad, en el que identificamos sitios con alineación significativa con el par de cebadores 515F-806R utilizado, lo que explica la anomalía observada. amplificación objetivo (Fig. 1B).

El problema de la amplificación fuera del objetivo en muestras de biopsias de esófago, estómago y duodeno. (A) Porcentaje de variantes de secuencia de amplicones (ASV) alineadas con el genoma humano producidas por la secuenciación Illumina MiniSeq de 2 × 150 pb de amplicones dirigidos a las regiones V4 y V1-V2. E esófago, EAC adenocarcinoma de esófago, S estómago, D duodeno. (B) Alineación de los cebadores de amplificación de la región V4 con el haplogrupo de mitocondrias de Homo sapiens; El ID de secuencia corresponde a la base de datos de nucleótidos del NCBI.

Este problema no abordado de amplificación no específica significativa también se describió recientemente durante el análisis de biopsias de tejido mamario y de esófago utilizando cebadores dirigidos a la región V3-V4 con el protocolo estandarizado para el sistema Illumina MiSeq12. Esto muestra que, aunque la secuenciación del gen 16S rRNA amplificado mediante cebadores específicos de bacterias es una alternativa para superar los problemas comunes relacionados con la contaminación humana significativa en la metagenómica de escopeta sin amplificación4, la necesidad de utilizar cebadores altamente degenerados puede no eliminar completamente este problema. .

Walker y cols. demostró que las muestras de biopsia humana deben amplificarse preferentemente utilizando cebadores dirigidos a la región V1-V2 (SD-Bact-0027-bS-20 y SD-Bact-0338-aA-18) en lugar de la región V3-V4 (Fig. 2) , ya que muestran una menor amplificación fuera del objetivo del ADN humano en la secuenciación del gen 16S rRNA12. Sin embargo, utilizaron un protocolo de amplificación de dos pasos para la región V1-V28, lo que proporcionó amplicones con una longitud promedio de ≈ 310 pb, lo que no es ideal para Illumina MiniSeq, Nextseq o iSeq, todos ellos secuenciadores de ADN rentables y de alto rendimiento. plataformas que producen solo secuencias ≤ 300 bases. Por lo tanto, diseñamos un nuevo conjunto de cebadores de amplificación, basado en los cebadores SD-Bact-0049-aS-2116 y SD-Bact-0338-aA-1917 descritos anteriormente que dan una longitud promedio de amplicón de ≈ 260 pb, incluidos adaptadores celulares e índices adecuados. para un protocolo de amplificación de un solo paso (Fig. 2).

La localización de cebadores para la amplificación de las regiones V1-V4 del gen 16S rRNA.

El nuevo análisis de todas las muestras de biopsia del esófago con este conjunto de cebadores V1-V2 mostró que el número de ASV alineados con el genoma humano en todos los sitios de biopsia se redujo prácticamente a cero (Fig. 1A). En particular, cuando Walker et al. utilizaron los cebadores SD-Bact-0027-bS-20 y SD-Bact-0338-aA-18, aproximadamente el 30% de las lecturas todavía estaban alineadas con el ADN humano12. De hecho, la curva de rarefacción producida por los datos de secuenciación correspondientes a los pares de cebadores V1-V2 y V4 mostró significativamente más ASV en muestras amplificadas con los cebadores V1-V2 (Figura complementaria S1) y estos cebadores también tienen consistentemente índices de diversidad alfa significativamente más altos. en comparación con los cebadores dirigidos a la región V4 (Fig. 3A), lo que confirma la mayor resolución taxonómica que se ha observado anteriormente6. El análisis de los diez filos más abundantes en ambas regiones analizadas correspondió a la composición bacteriana típica del tracto gastrointestinal (GI) superior18,19,20,21,22. La comparación por pares de muestras amplificadas con cebadores V1-V2 y V4 mostró una representación significativamente mayor de Actinobacteria y Proteobacteria, una representación menor del filo Bacteroidota y la ausencia del filo Fusobacteriota en muestras amplificadas con cebadores V1-V2 (Fig. 3B). Se han observado diferencias similares en estudios recientes que analizan la estructura del bacterioma de biopsias esofágicas, entre las muestras analizadas con los cebadores V423,24 o V3-V425,26 cuando nuestros resultados de la región V1-V2 están muy cerca del perfil del bacterioma de Li et al. Alabama. analizado con los cebadores V3-V426 de biopsias de esófago. Sin embargo, debido a una ausencia total en las muestras amplificadas con los cebadores V1-V2 del filo Fusobacteriota en la microbiota esofágica27, hicimos una alineación de ambos cebadores V1-V2 con el gen 16S rRNA de Fusobacteriota. Esto mostró una falta de coincidencia de dos bases en el extremo 3' del cebador SD-Bact-0049-aS-21 y, por lo tanto, diseñamos un cebador directo adicional 68F_M (Tabla 1) dirigido a Fusobacteriota y, junto con los cebadores originales, amplificamos una vez más todas las biopsias. muestras del esófago. La estructura de la comunidad en muestras amplificadas con esta mezcla modificada de cebadores V1-V2 (V1-V2M) mostró especies significativamente más observables gracias a la amplificación del filo Fusobacteriota (Fig. 3A), aunque el perfil fue generalmente similar al obtenido usando el original. Cebadores V1 – V2 (Fig. 3B).

Comparación de muestras de esófago utilizando cebadores dirigidos a las regiones V1-V2 y V4 del gen 16S rRNA. (A) Comparación de los índices de diversidad alfa promedio entre las muestras amplificadas con los cebadores V1-V2 y V4. (B) Composición promedio de la muestra a nivel de filo: se muestran los diez filos más abundantes. Las pruebas estadísticas se realizaron mediante la prueba de Wilcoxon (***< 0,001, **< 0,01, NS no significativo).

A continuación, analizamos la estructura de la comunidad bacteriana identificada utilizando los cebadores V1-V2M y V4 en muestras de biopsia del esófago, el estómago y el duodeno que representan el tracto gastrointestinal superior completo (Fig. 4). Observamos una riqueza taxonómica estimada significativamente mayor a nivel de especie en términos de todos los índices de diversidad alfa ampliamente utilizados para las muestras de esófago y duodeno amplificadas con cebadores V1-V2M en comparación con los cebadores V4 (Fig. 4A). Solo las muestras de biopsia gástrica no mostraron diferencias observables en la riqueza taxonómica entre V4 y V1-V2M como consecuencia de la gran abundancia del filo Campylobacterota (hasta 95%, figura complementaria S2) en varios pacientes. Esto se debió a la presencia de la bacteria Helicobacter pylori, un patógeno estomacal muy extendido asociado con el riesgo de gastritis crónica, úlcera péptica y adenocarcinoma gástrico28. Debido a que la composición taxonómica del tracto gastrointestinal superior promedio varió entre ubicaciones individuales (Fig. 4B), realizamos un análisis detallado de la riqueza taxonómica de las muestras de biopsia del esófago, ya que formaban el grupo más grande y se recolectaron de múltiples sitios en cada paciente. .

Análisis de muestras de biopsia del tracto gastrointestinal superior utilizando cebadores dirigidos a las regiones V1-V2M y V4 del gen 16S rRNA. (A) Comparación de los índices de diversidad alfa promedio entre muestras amplificadas por los cebadores V1-V2M y V4. Las pruebas estadísticas se realizaron mediante la prueba de Wilcoxon (***< 0,001, **< 0,01, NS no significativo). (B) Composición promedio de la muestra a nivel de filo: se muestran los diez filos más abundantes. (C) Análisis de coordenadas principales (PCoA) basado en la distancia de Jaccard; la significación estadística fue probada por PERMANOVA. Todos los análisis se realizaron a partir de 6 biopsias de duodeno, 11 biopsias de estómago y 23 biopsias de esófago amplificadas con cebadores V1-V2M y V4.

Como se esperaba del análisis de la curva de rarefacción (Figura complementaria S1), los cebadores V1-V2M mostraron una riqueza taxonómica significativamente mayor a nivel de género y especialmente a nivel de especie (Figura 5A). Notablemente, con los cebadores V4, no hubo diferencias en la riqueza taxonómica entre los niveles de género y especie. Por otro lado, la asignación taxonómica de ambos pares de cebadores mostró una eficiencia comparable a nivel de género y especie (Fig. 5B). Sin embargo, cuando analizamos la reproducibilidad del análisis en seis pacientes, encontramos una correlación significativamente mayor con los cebadores V1-V2M en comparación con los cebadores V4 entre dos muestras de biopsia esofágica recolectadas de un paciente (Fig. 5C).

Resolución taxonómica y reproducibilidad del análisis para cada conjunto de datos específicos del gen 16S rRNA de muestras de biopsia esofágica. (A) Riqueza taxonómica (nivel de género y especie) con amplicones V1-V2M y V4 (n = 36; se omitieron 4 muestras con una alta prevalencia de Helicobacter pylori). Las pruebas estadísticas se realizaron utilizando la prueba T de Student (***< 0,001, **< 0,01) (B) Porcentaje de secuencias con taxonomía asignada (nivel de género y especie) para cada conjunto de datos basado en amplicones (n = 36; 4 muestras con una alta prevalencia de H. pylori). Las pruebas estadísticas se realizaron mediante la prueba T de Student; NS no significativo (C) Coeficientes de correlación de Pearson calculados a partir de dos muestras de biopsia esofágica recolectadas de un paciente para cada conjunto de datos basado en amplicones (n = 6). Las pruebas estadísticas se realizaron utilizando la prueba T de Student (*< 0,05).

Esta baja reproducibilidad sugiere un sesgo de PCR dentro de la amplificación de regiones V4 del gen 16S rRNA individual como resultado de una amplificación masiva fuera del objetivo. De hecho, este resultado está en línea con la entropía de secuencia (variabilidad) para las regiones V1-V2 y V46 y confirma hallazgos previos del análisis de la microbiota urinaria e intestinal de que el amplicón del gen V1-V2 16S rRNA es mucho más informativo en términos taxonómicos. riqueza en comparación con el amplicón V410,11. Por otro lado, el análisis de la región V1-V2 no mostró una clasificación de secuencia deficiente en la identificación de taxones bacterianos pertenecientes al filo Proteobacteria, como se predijo en un experimento in-silico previo basado en secuencias del gen 16S rRNA de una base de datos pública de Greengenes6. .

Con respecto a los filos con una representación promedio superior al 0,5% de Bacteroidota, se detectaron Firmicutes, Proteobacteria, Fusobacteriota, Campylobacterota, Actinobacteriota y Spirochaetota en ambos conjuntos de datos de amplicones. Las patescibacterias y cianobacterias detectadas solo con el conjunto de datos V1-V2M también estaban presentes en el conjunto de datos V4, pero su representación fue inferior al 0,1% (Figura complementaria S3A). En el caso de filos poco abundantes (<0,5%), nueve eran comunes a ambos conjuntos de datos y algunos filos se detectaron exclusivamente en un subconjunto con una abundancia relativa promedio total de sólo <0,01% (Figura complementaria S3B). Se han descrito principalmente como bacterias termófilas o arqueas presentes en el suelo o en aguas termales29,30,31, lo que indica contaminación o clasificación taxonómica errónea. La evaluación de la intersección entre géneros con una representación promedio superior al 0,5% presente en los conjuntos de datos V4 y V1-V2M mostró que 17 géneros estaban presentes en ambos conjuntos de datos. El segundo grupo más grande estaba compuesto por 16 géneros presentes en el conjunto de datos V1-V2M y 4 géneros presentes en el conjunto de datos V4. De los 20 géneros presentes en un conjunto de datos, solo dos (Capnocytophaga y Leptotrichia) no se identificaron en el conjunto de datos V1-V2M y cuatro (Cutibacterium, Jeotgalicoccus, Pseudomonas y TM7x) no se identificaron en el conjunto de datos V4.

Por otro lado, observamos discrepancias entre los conjuntos de datos de amplicones en la composición bacteriana según la abundancia relativa de taxones. Debido a esta diferencia sustancial, realizamos un análisis de diversidad beta para cada ubicación del tracto gastrointestinal superior (esófago, estómago y duodeno). Utilizando el análisis de coordenadas principales (PCoA) ordenado según la distancia de Jaccard, observamos una agrupación estadísticamente significativa entre los conjuntos de datos V4 y V1-V2M en todas las ubicaciones que muestran una separación en el Eje1 (Fig. 4C). El análisis de géneros significativamente diferentes (P <0,05, presencia promedio >0,5%) entre los conjuntos de datos de biopsias de esófago y duodeno mostró una mayor representación de los géneros abundantes Prevotella, Fusobacterium y Streptococcus en el conjunto de datos V4 y Neisseria, Haemophilus y Rothia en el conjunto de datos V1 – V2M (Fig. 6). En las biopsias del estómago, observamos una mayor representación de los abundantes géneros Prevotella y Fusobacterium solo en el conjunto de datos V4 (Fig. 6). De hecho, el género Tmx7 estuvo casi ausente en todos los conjuntos de datos V4, y el género Leptotrichia estuvo casi ausente en los conjuntos de datos V1-V2M (Fig. 6).

Diferentes representaciones de géneros entre conjuntos de datos específicos de amplicones V1-V2M y V4 de muestras de biopsia de esófago, estómago y duodeno. Los géneros que muestran representaciones estadísticamente diferentes (P <0,05, analizado mediante la prueba de Wilcoxon) entre amplicones de las regiones V1-V2M y V4 del gen 16S rRNA se clasifican en el gráfico según su abundancia (media base: eje Y) y su abundancia relativa. relación (log2FoldChange—eje X).

La mayor representación del género Prevotella se reflejó en la mayor representación del filo Bacteriodota en el conjunto de datos V4 y de manera similar, la mayor representación de los géneros Neisseria, Haemophilus y Rothia se reflejó en la mayor representación de los filos Proteobacteria y Actinobacteria en el V1. -Conjunto de datos V2M (Fig. 4B). Con base en estos resultados, verificamos la alineación de ambos conjuntos de cebadores con todos los representantes que muestran grandes discrepancias y encontramos que hay una falta de coincidencia de 2 bases en el extremo 3' del cebador SD-Bact-0049-aS-21 solo en el género Leptotrichia. , lo que explica la mala amplificación observada de este género con los cebadores V1-V2M. Las diferencias en la composición relativa de taxones en los dos conjuntos de datos confirman estudios previos que muestran que el conjunto de cebadores del gen 16S rRNA particular utilizado influye sustancialmente en el análisis de la diversidad y composición de las bacterias10,32,33,34,35. Análisis recientes de bacteriomas en biopsias del tracto gastrointestinal superior utilizando pares de cebadores V3-V4 o V4 mostraron que la composición relativa de los taxones varió ampliamente23,24,25,26 entre los conjuntos de cebadores individuales con una mayor abundancia de Bacteroidota en el caso de V4. cebadores23,24 y mayor abundancia de Actinobacterias y Proteobacterias en el caso de los cebadores V3-V425,26. También se describió una tendencia similar para el análisis de la microbiota intestinal utilizando los cebadores V4-V5 y V3-V434. Además, la mayor representación del género Streptococcus en nuestro conjunto de datos V4 está en línea con un estudio previo que analiza comunidades orales y simuladas utilizando la plataforma Illumina MiSeq mediante el uso de cebadores V1-V3 y V3-V4 del gen 16S rRNA en el que los autores sugieren que el género V1 –La región V3 proporcionó una representación más precisa de la diversidad microbiana oral35.

Secuenciamos una comunidad de referencia simulada disponible comercialmente, ZymoBIOMICS Fecal Reference con TruMatrix Technology (FRT) y ZymoBIOMICS Gut Microbiome (GM) Standard (Zymo Research, EE. UU.), para evaluar el sesgo en el perfil de composición microbiana basado en cebadores V1-V2M. La representación de cada género en el estándar GM se comparó con los datos de la secuenciación de los estándares utilizando los cebadores V1-V2M y V4. Para el estándar FRT, los datos de secuenciación sin procesar disponibles se analizaron al nivel de géneros> 1% de abundancia y se compararon con nuestros datos (Fig. 7). Ambos conjuntos de datos, V1 – V2M y V4, mostraron un grado muy alto de correlación con las comunidades bacterianas en los dos estándares (Fig. 7B, D). En el caso del estándar GM, los cebadores V4 subestimaron ligeramente los géneros Veilonella y Limosilactobacillus y los cebadores V1-V2M subestimaron ligeramente el género Bacteroides. Un análisis de la comunidad FRT mostró una representación ligeramente mayor de los géneros Bacteroides, Agathobacter y Subdoligranulum en el conjunto de datos del cebador V4 y de Anaerostipes en el conjunto de datos V1-V2M. Sin embargo, en general, estos resultados muestran que los cebadores V1-V2M proporcionan datos comparables a los cebadores V4.

Comparación de la estructura bacteriana de los estándares ZymoBIOMICS analizados con los cebadores V4 y V1-V2M. Referencia fecal de ZymoBIOMICS con tecnología TruMatrix (FRT) y estándar de microbioma intestinal (GM) de ZymoBIOMICS (Zymo Research, EE. UU.) analizados mediante secuenciación del gen 16S rRNA utilizando pares de cebadores V4 y V1-V2M y secuenciados en Illumina MiniSeq (2 × 150 pb). (A,C) Composición promedio de la muestra a nivel de género: se muestran los géneros estándar FRT que representan más del 1%. (B,D) Gráficos de dispersión de las abundancias del género para los pares de cebadores V4 y V1-V2M utilizados para la secuenciación del gen 16S rRNA con el coeficiente de correlación de Pearson.

La principal limitación de este y otros estudios suele ser la falta de información sobre la verdadera composición taxonómica de la muestra analizada. Sin embargo, seleccionar las regiones hipervariables del gen 16S rRNA apropiadas para el análisis es una consideración crítica para caracterizar las comunidades bacterianas relevantes y eliminar el sesgo debido a la amplificación fuera del objetivo. El desarrollo de una metodología para el análisis de metagenomas de biopsias humanas es fundamental tanto para la investigación médica como para la práctica clínica. Las técnicas de secuenciación del gen 16S rRNA actualmente disponibles, incluidas las plataformas de secuenciación de tercera generación (MinION, PacBio), no son óptimas para el examen de muestras con baja abundancia de bacterias con una proporción predominante de ADN humano. En nuestro estudio, hemos diseñado un conjunto de cebadores para la secuenciación del gen ARNr 16S del amplicón V1-V2 de bacterias presentadas en biopsias humanas que, en combinación con las plataformas Illumina MiniSeq/Nextseq/iSeq, mantienen la eficiencia de este método y al mismo tiempo tiempo reduciendo radicalmente su precio.

El estudio se realizó con la aprobación de los Comités de Ética del Hospital Universitario de Brno (Nº 05-101019/EK, 15 de mayo de 2019). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de su inclusión en el estudio y el estudio está en línea con la declaración de Helsinki. Se recogieron 17 muestras de esófago, 6 muestras de adenocarcinoma de esófago, 11 muestras de estómago y 6 muestras de duodeno de 7 pacientes con enfermedad por reflujo gastroesofágico (ERGE) y 6 pacientes con adenocarcinoma de esófago (EAC) en el Departamento de Gastroenterología y Medicina Interna. , Hospital Universitario de Brno. Las biopsias se colocaron en tubos estériles de 2 ml con 2 g de perlas cerámicas de homogeneización de 1,4 mm (Qiagen, Hilden, Alemania) y 600 µl de tampón de lisis RLT del kit de aislamiento AllPrep DNA/RNA 96 (Qiagen, Hilden, Alemania) y se congelaron. inmediatamente a -80 °C hasta la extracción del ADN.

Las muestras se descongelaron a temperatura ambiente y se añadió 2-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE. UU.) a cada muestra hasta una concentración final del 1% y se homogeneizó mecánicamente 2 x 50 s a 6500 RPM usando un homogeneizador Precellys Evolution (Bertin Technologies SAS, Francia). Luego, las muestras (y el control negativo de extracción de ADN) se procesaron para la extracción de ADN utilizando el kit AllPrep DNA/RNA 96 (Qiagen Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo de centrifugado del fabricante y el ADN eluido se almacenó a -20 °C hasta su posterior análisis. . El estándar de referencia fecal ZymoBIOMICS (Zymo Research, EE. UU.) se procesó para la extracción de ADN utilizando el kit ZymoBIOMICS DNA Miniprep (Zymo Research, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo de centrifugado del fabricante y el ADN eluido se almacenó a -20 °C hasta su posterior análisis.

El ADN genómico se amplificó en una reacción de PCR con cebadores dirigidos a las regiones variables V1-V2 (68F16-338R17) y V4 (515F-806R36) del gen 16S rRNA. La amplificación de la región V4 se realizó de acuerdo con el protocolo EMP descrito anteriormente en MiniSeq y para la región V1-V2, agregamos índices y adaptadores de celda de flujo Illumina MiniSeq a los cebadores descritos anteriormente. Las secuencias y los detalles de los cebadores utilizados se procesaron en OligoAlanyzer (Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, EE. UU.) y se proporcionan en la Tabla 1. La amplificación de ambas regiones variables se realizó en reacciones de 50 µL, que contenían 20 µL de Platino. II Hot-Start PCR Master Mix (2X) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.), 0,1–0,3 µmol L-1 de cebadores (consulte la Tabla 1) y 6 µL de plantilla. El perfil térmico comenzó con una desnaturalización inicial de 94 °C × 3 min, seguida de 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C × 45 s, recocido a 52 °C × 1 min y extensión a 72 °C × 1 min 30 s, y un extensión final a 72 °C durante 10 min. Se utilizaron perlas SPRIselect (Beckman Coulter, California, EE. UU.) para la purificación del producto de PCR. Después de verificar la longitud de los productos de PCR en el sistema 5200 Fragment Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, California, EE. UU.) y determinar su concentración mediante el fluorómetro Quantus (Promega, Madison, Wisconsin, EE. UU.), los productos de PCR se combinaron a una velocidad estandarizada. concentración de 4 nM. La biblioteca agrupada se preparó y se sometió al kit MiniSeq Mid Output (secuenciación de extremos emparejados 2 × 150) en el secuenciador MiniSeq (Illumina, San Diego, California, EE. UU.) utilizando cebadores de secuenciación personalizados para V4 y V1-V2 (consulte la Tabla 1). .

Los controles negativos consistieron en controles de solo reactivo que consistían en tubos de recolección vacíos a los que se agregó toda la extracción de ADN, la PCR y la preparación de la biblioteca. Se incluyeron tres controles de reactivos para cada placa de análisis de región variable.

Las lecturas fastq sin procesar se asignaron al genoma humano hg38 utilizando el paquete Rbowtie2 (versión 1.14.0)37. Luego, las lecturas asignadas correctamente se restaron del conjunto de datos. El resto de las lecturas se procesaron utilizando el paquete DADA238 (versión 1.20.0) en R (versión 4.1.1). El análisis se llevó a cabo según el procedimiento operativo estándar con la adición de concatenación de lecturas. Brevemente, las lecturas se filtraron y recortaron primero (máximo de 0 bases ambiguas, umbral de error esperado de 2 y las últimas 10 bases truncadas). Luego, las lecturas filtradas se eliminaron de la replicación (se extrajeron secuencias únicas) y se eliminaron el ruido (los errores de secuenciación identificados se eliminaron utilizando tasas de error aprendidas y perfiles de calidad de las lecturas). Las lecturas superpuestas se fusionaron y las lecturas no superpuestas se concatenaron. Luego se eliminaron las quimeras y se asignó la taxonomía mediante el método clasificador bayesiano ingenuo RDP39 frente a la base de datos de referencia SILVA40 (versión 138.1). La identificación y eliminación de secuencias de ADN contaminantes se realizó mediante el paquete R decontam41 utilizando firmas de ADN contaminante ampliamente reproducidas (Tabla complementaria S1). Se construyó un árbol filogenético utilizando el paquete phangorn42 (versión 2.7.1) y el paquete DECIPHER (versión 2.20.0) utilizado para alineamientos múltiples. Los paquetes phyloseq43 (versión 1.36.0), vegan44 (versión 2.6.2), microbiome45 (versión 1.14.0), MicrobiotaProcess46 (versión 1.4.4) y DESeq247 (versión 1.32.0) se utilizaron para análisis filogenéticos y estadísticos posteriores. y se utilizaron los paquetes ggplot2, ggtree48 (versión 3.0.4) y patchwork49 (1.1.1) para producir resultados gráficos.

Los conjuntos de datos generados y analizados durante el estudio actual están disponibles en la SRA con los ID de BioProject: PRJNA877810 y PRJNA995527. Los códigos DADA2 utilizados para analizar los datos se proporcionan en el material complementario.

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Este estudio fue apoyado por el Ministerio de Salud de la República Checa, subvención n. NU20-03-00126 y por el Ministerio de Salud de la República Checa: desarrollo conceptual de la organización de investigación (FNBr, 65269705, Sup 3/21). Los recursos computacionales fueron proporcionados por el proyecto "e-Infrastruktura CZ" (e-INFRA CZ LM2018140) apoyado por el Ministerio de Educación, Juventud y Deportes de la República Checa. Este trabajo se realizó con el apoyo de RECETOX Research Infrastructure (ID LM2018121, MEYS CR, 2020-2022) y el proyecto CETOCOEN EXCELLENCE (No CZ.02.1.01/0.0/0.0/17_043/0009632) financiado por el Ministerio de Educación , Juventud y Deportes para el apoyo a la infraestructura. Agradecemos a CF Genomics CEITEC MU apoyado por la infraestructura de investigación NCMG (LM2018132 financiado por MEYS CR) por su apoyo en la obtención de los datos científicos presentados en este artículo. Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el acuerdo de subvención No 857560. Esta publicación refleja únicamente la opinión de los autores y la Comisión Europea no es responsable del uso que pueda hacerse de la información que contiene.

Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad Masaryk, Kamenice 735/5, 62500, Brno, República Checa

Tereza Deissová, Martina Zapletalová y Jan Lochman

Departamento de Gastroenterología y Medicina Interna, Hospital Universitario de Brno y Facultad de Medicina, Masaryk, Universidad, Jihlavská 20, 62500, Brno, República Checa

Lumir Kunovský, Radek Kroupa y Tomáš Grolich

Departamento de Cirugía, Hospital Universitario de Brno y Facultad de Medicina, Universidad Masaryk, Jihlavská 20, 62500, Brno, República Checa

Lumir Kunovský y Zdeněk Kala

Departamento de Fisiopatología, Facultad de Medicina, Universidad Masaryk, Jihlavská 20, 62500, Brno, República Checa

Petra Bořilová Linhartová y Jan Lochman

Facultad de Ciencias, RECETOX, Universidad Masaryk, Kotlářská 2, Brno, República Checa

Petra Borilová Linhartová

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Conceptualización, JL y ABP; análisis de secuencia y datos estadísticos, MZ y TD; adquisición de financiación, PBL, ZK; investigación, JL, MZ, PBL, TD y ZK; examen clínico y recogida de muestras, LK y RK; supervisión, JL y ABP; redacción: borrador original, JL y TD; revisión y edición, todos coautores. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a Jan Lochman.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Deissová, T., Zapletalová, M., Kunovský, L. et al. La elección del cebador del gen 16S rRNA afecta la amplificación fuera del objetivo en biopsias del tracto gastrointestinal humano y perfiles de microbioma. Representante científico 13, 12577 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39575-8

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Recibido: 24 de marzo de 2023

Aceptado: 27 de julio de 2023

Publicado: 03 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39575-8

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