Los genes 18S rRNA de los parásitos Haemoproteus (Haemosporida, Apicomplexa) de pájaros cantores europeos con comentarios sobre diagnósticos mejorados de parásitos

Malaria Journal volumen 22, Número de artículo: 232 (2023) Citar este artículo

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Se supone que los genes de ARN ribosómico nuclear de los parásitos Plasmodium evolucionan según un modelo de nacimiento y muerte con nuevas variantes que se originan por duplicación y otras se eliminan. Para algunas especies de Plasmodium, se ha demostrado que distintas variantes de los genes 18S rRNA se expresan de manera diferencial en huéspedes vertebrados y mosquitos vectores. El objetivo central fue evaluar si los parásitos hemosporidios aviares del género Haemoproteus también tienen variantes 18S sustancialmente distintas, centrándose en linajes pertenecientes a los grupos de especies Haemoproteus majoris y Haemoproteus belopolskyi.

Se secuenciaron los genes 18S rRNA casi completos de 19 linajes Haemoproteus del subgénero Parahaemoproteus, que son comunes en aves paseriformes del Paleártico. Los productos de PCR de 20 muestras de sangre y tejido que contenían 19 linajes de parásitos se sometieron a clonación molecular y se secuenciaron diez clones en promedio cada uno. Se analizaron las características de la secuencia y se calcularon árboles filogenéticos, incluidos los datos de secuencia publicados previamente de ocho linajes adicionales de Parahaemoproteus. La distribución geográfica y de huéspedes de los 27 linajes se visualizó como redes de haplotipos CytB y gráficos circulares. Con base en los datos de la secuencia 18S, se diseñaron sondas de oligonucleótidos específicas de cada especie para atacar los parásitos en el tejido huésped mediante ensayos de hibridación in situ.

La mayoría de los linajes de Haemoproteus tenían dos o más variantes del gen 18S como muchas especies de Plasmodium, pero las distancias máximas entre variantes eran generalmente menores. Además, a diferencia de la mayoría de las especies de Plasmodium de mamíferos y aves, las secuencias 18S de todos los linajes de parásitos excepto uno se agruparon en clados recíprocamente monofiléticos. Solo se encontraron grupos 18S considerablemente distintos en Haemoproteus tartakovskyi hSISKIN1 y Haemoproteus sp. hROFI1. La presencia de variantes quiméricas de 18S en algunos linajes de Haemoproteus indica que sus unidades ribosómicas evolucionan más bien de forma semiconcertada que según un modelo estricto de evolución de nacimiento y muerte.

Los parásitos del subgénero Parahaemoproteus contienen distintas variantes de 18S, pero la variabilidad intraespecífica es menor que en la mayoría de las especies de Plasmodium de mamíferos y aves. Los nuevos datos del 18S proporcionan una base para investigaciones más exhaustivas sobre el desarrollo de parásitos Haemoproteus en el tejido del huésped utilizando técnicas de hibridación in situ dirigidas a linajes de parásitos específicos.

Los ARN ribosómicos constituyen la parte central de los ribosomas, que son esenciales para la síntesis de proteínas en todas las células. Las unidades ribosómicas nucleares de los eucariotas contienen los genes del ARNr 18S, el ARNr 5,8S y el ARNr 28S, separados por los espaciadores transcritos internos ITS1 e ITS2. Los genes 5S rRNA se encuentran en diferentes regiones genómicas. El ARNr 18S es parte de la subunidad ribosomal pequeña (SSU), y el ARNr 28S, el ARNr 5.8S y el ARNr 5S son parte de la subunidad ribosomal grande (LSU). Las unidades ribosómicas de la mayoría de los eucariotas están dispuestas en grupos de repeticiones en tándem en uno o varios cromosomas, por lo que cada grupo contiene múltiples copias de unidades ribosómicas. Debido a limitaciones funcionales, los ARN ribosómicos nucleares se encuentran entre los genes más conservados en los eucariotas. Se supone que las unidades ribosómicas evolucionan según un modelo de evolución concertada que conduce a la homogeneización [1, 2]. Los mecanismos de evolución concertada probablemente implican un cruce desigual durante la recombinación, la duplicación de genes y la conversión de genes intercromosómicos [3]. Sin embargo, los genes ribosómicos nucleares de los parásitos Plasmodium son excepcionales porque se supone que sus unidades ribosómicas evolucionan según un modelo de nacimiento y muerte con nuevas variantes que se originan por duplicación y otras se eliminan [4]. Los estudios sobre los genes 18S rRNA de especies de Plasmodium humanos y roedores encontraron que las secuencias de unidades individuales pueden variar sustancialmente [5], y distintas variantes se expresan de manera diferencial en los huéspedes vertebrados y mosquitos [6]. Las secuencias 18S expresadas en los huéspedes vertebrados y en los mosquitos vectores se denominaron variantes de tipo A y tipo S, respectivamente [6, 7]. Este patrón se encontró en especies de Plasmodium de roedores, simios y humanos (excepto Plasmodium malariae), con diferencias de tipo A y tipo S entre un 10% y un 17% [8].

El primer estudio exhaustivo sobre genes ribosómicos nucleares de parásitos hemosporidios aviares fue publicado por Harl et al. [8], quienes secuenciaron los genes 18S de siete linajes de Plasmodium, nueve Haemoproteus y 16 Leucocytozoon. La mayoría de los linajes de Plasmodium aviares estudiados también presentan grupos de variantes distintas de 18S, que difieren hasta en un 14,9%. Se encontró un patrón similar en el grupo Leucocytozoon toddi, pero las secuencias 18S de otros parásitos Leucocytozoon y Haemoproteus eran menos variables y carecían de grupos de variantes muy divergentes, excepto Haemoproteus tartakovskyi [8].

El género Haemoproteus comprende actualmente alrededor de 180 especies descritas morfológicamente, pero se dispone de datos genéticos moleculares de menos de la mitad de las especies [9]. La base de datos MalAvi (http://130.235.244.92/Malavi/; consultada en diciembre de 2022) contiene más de 1500 linajes únicos de Haemoproteus que cubren toda o casi toda la región del código de barras CytB de 478 pb. La gran mayoría aún no se ha relacionado con morfoespecies, por lo que las especies conocidas sólo constituyen una fracción de la diversidad de especies. El género incluye los dos subgéneros Haemoproteus y Parahaemoproteus. Los parásitos del subgénero Haemoproteus se encuentran principalmente en aves de los órdenes Columbiformes, Suliformes y Charadriiformes y son transmitidos por piojos (Hippoboscidae). Los parásitos del subgénero Parahaemoproteus son extremadamente diversos en las aves paseriformes de todo el mundo, particularmente en el hemisferio norte, y se transmiten mediante mosquitos picadores (Ceratopogonidae).

Para el presente estudio, se secuenciaron los genes de ARNr 18S de 19 linajes de Haemoproteus. Aproximadamente la mitad de los linajes investigados están actualmente vinculados a los grupos Haemoproteus majoris (hCCF5, hCWT4, hEMSPO03, hPARUS1, hPHSIB1 y hWW2) y Haemoproteus belopolskyi (hACDUM2, hARW1, hMW3 y hSW1), que incluyen algunas de las aves más comunes. Linajes de hemosporidios en aves paseriformes del Paleártico. Además, se secuenciaron las secuencias 18S de Haemoproteus balmorali hCOLL3, Haemoproteus fringillae hCCF3, Haemoproteus sp. hROFI1, Haemoproteus nucleocondensus hGRW01, Haemoproteus parabelopolskyi hSYAT02, Haemoproteus payevskyi hRW1, Haemoproteus cf. magnus hCCF6, y los linajes aún no vinculados hCCF2 y hCWT7. Las secuencias de ocho linajes de Haemoproteus publicadas previamente por Harl et al. [8] se incluyeron en los análisis.

La pregunta principal era si los parásitos aviares Haemoproteus presentan grupos de variantes distintas de 18S como muchas especies de Plasmodium, lo que indicaría que sus genes ribosómicos también podrían expresarse diferencialmente en las aves hospedadoras y en los vectores dípteros. Además, los genes ribosomales constituyen una gran parte de las moléculas de ARN en las células y, por lo tanto, son objetivos adecuados para enfoques genéticos moleculares como los ensayos de hibridación in situ. Las secuencias 18S fueron la base para diseñar sondas de oligonucleótidos específicas de especies/linaje, que pueden usarse para apuntar a parásitos en secciones histológicas y diferenciarlos en coinfecciones.

Para el presente estudio, se secuenciaron los genes 18S rRNA de 19 linajes de Haemoproteus encontrados en aves paseriformes en el Paleártico. Las muestras formaban parte de las colecciones del Centro de Investigación de la Naturaleza de Vilna (Lituania) y del Instituto de Patología de la Universidad de Medicina Veterinaria de Viena (Austria). Se recolectaron aves silvestres en la Estación Ornitológica de Cabo Ventė (Lituania) mediante trampas estacionarias (grandes tipo 'Rybachy', en zigzag y en embudo) y redes de niebla entre 2018 y 2021, y se tomaron muestras de sangre con microcapilares heparinizados tras punción de la vena braquial. . Se utilizaron gotas de sangre fresca para preparar manchas de sangre en papel de filtro para el análisis de ADN y varias extensiones de sangre en portaobjetos de vidrio para examen microscópico. Los frotis de sangre se fijaron en metanol absoluto durante un minuto y luego se tiñeron con Giemsa al 10% [10]. Los frotis de sangre se analizaron mediante examen microscópico y 60 aves con alta parasitemia fueron sacrificadas por decapitación según los permisos (ver Declaración ética). Se tomaron muestras de sangre de dos aves (AH1663 y AH1664) durante un anillamiento de rutina de aves en la Estación Biológica Neusiedler See (Illmitz, Burgenland) en 2018, como se describe anteriormente. Se tomaron muestras de tejido (hígado) de un ave muerta (AH2023) enviadas al Instituto de Patología (Vetmeduni Viena) para un estudio de ciencia ciudadana en 2020 [11] y se almacenaron a -80 °C para el análisis de ADN. Se fijaron muestras de órganos de las aves muertas en formalina, se incluyeron en parafina (FFPE) y se depositaron en la colección de tejidos del Instituto de Patología (Vetmeduni Viena). Los frotis de sangre de las muestras lituanas se depositaron en el Centro de Investigación de la Naturaleza. El ADN se aisló de manchas de sangre en papeles de filtro o de tejido hepático congelado utilizando el kit DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN, Venlo, Países Bajos). Se siguió el protocolo del fabricante para el aislamiento de ADN a partir de tejido, pero se prepararon dos eluatos de 100 µl cada uno a partir de la misma columna, el primero a 8.000 rpm y el segundo a 13.000 rpm. El segundo eluato se utilizó para las PCR. La información sobre las muestras analizadas para el presente estudio se proporciona en la Tabla 1. La tabla también incluye información sobre las muestras estudiadas por [8], quien publicó previamente secuencias 18S de ocho linajes de Parahaemoproteus.

El ensayo de PCR anidada descrito por [12] se utilizó para obtener un fragmento de 478 pb del gen del citocromo B (CytB), la secuencia de código de barras de ADN común para los parásitos hemosporidios aviares. Las PCR se realizaron utilizando los cebadores HaemNFI (5′-CAT ATA TTA AGA GAA NTA TGG AG-3′) y HaemNR3 (5′-ATA GAA AGA TAA GAA GAA ATA CCA TTC-3′) en la primera PCR, y HaemF (5 ′-ATG GTG CTT TCG ATA TAT GCA TG-3′)/HaemR2 (5′-GCA TTA TCT GGA TGT GAT AAT GGT-3′) y HaemFL (5′-ATG GTG TTT TAG ATA CTT ACA TT-3′) /HaemR2L (5′-CAT TAT CTG GAT GAG ATA ATG GNG C-3′) en las PCR anidadas, respectivamente [12]. Los cebadores CytB_HPL_intF1 (5′-GAG AAT TAT GGA GTG GAT GGT G-3′) y CytB_HPL_intR1 (5′-ATG TTT GCT TGG GAG CTG TAA TC-3′) [8] se utilizaron para obtener secciones de 885 pb de CytB. , que se utilizaron para calcular los árboles filogenéticos.

Para amplificar casi todos los genes 18S rRNA de los linajes Haemoproteus, se utilizan los cebadores 18S_H_1F (5′-TGG TTG ATC TTG CCA GTA ATA TAT GT-3′) y 18S_H_1R (5′-CGG AAA CCT TGT TAC GAC TTTTG-3′) Se utilizaron, que están ubicados en el extremo 5′ y 22 pb del extremo 3′ del 18S, respectivamente [8]. Dado que las lecturas de la secuencia 18S de algunos linajes de Haemoproteus no se superpusieron, los cebadores específicos de Haemoproteus 18S_H_int_F (5′-AGA TCA AGT TGA AGT GCC AGC ATT-3′) y 18S_H_int_R (5′-CGT TAA ACA CGC GAC GTC-3′ ), que están ubicados aproximadamente a 550 pb y 1700 pb del extremo 5' del 18S, para secuenciar una sección de 1100 pb que cubre la parte media. Estos últimos cebadores sólo se dirigen a los genes de ARNr 18S del subgénero Parahaemoproteus, pero no a los del subgénero Haemoproteus, genéticamente muy divergente [8].

Las PCR dirigidas a la sección del código de barras CytB de 478 pb siguieron el protocolo de [12] y se realizaron utilizando la ADN polimerasa GoTaq® G2 Flexi (Promega, Wisconsin, Madison, EE. UU.). Las PCR comenzaron con una desnaturalización inicial de 2 min a 94 °C, seguida de 35 ciclos con 30 s a 94 °C, 30 s a 50 °C, 1 min a 72 °C y una extensión final de 10 min a 72 °C. °C. Cada 1 µl del primer producto de PCR se usó como plantilla en las dos PCR anidadas. Las PCR dirigidas al fragmento CytB de 885 pb se realizaron con GoTaq® Long PCR Master Mix (Promega, Wisconsin, Madison, EE. UU.). Las PCR comenzaron con una desnaturalización inicial de 2 min a 94 °C, seguida de 35 ciclos con 30 s a 94 °C, 30 s a 55 °C, 2 min a 68 °C y una extensión final de 10 min a 72 °C. °C. Las PCR dirigidas a las secuencias 18S se realizaron con GoTaq® Long PCR Master Mix en las mismas condiciones pero con un tiempo de extensión de 2 minutos. Se realizaron dos PCR cada una para obtener suficiente producto de PCR para la secuenciación directa y la clonación molecular. Los productos de la PCR se visualizaron en geles de agarosa LB al 1% y se enviaron a Microsynth Austria GmbH (Viena, Austria) para su purificación y secuenciación en ambas direcciones utilizando los cebadores de la PCR.

Los productos de PCR 18S se procesaron y sometieron a clonación molecular como se describe en [8]. Cada 20 µl de producto de PCR se ejecutaron en geles de agarosa LB al 1% y las bandas se cortaron con espátulas flameadas. Las bandas de gel se purificaron utilizando el kit QIAquick Gel-Extraction Kit (QIAGEN) siguiendo el protocolo estándar y eluyeron con 20 µl de agua destilada. La clonación se realizó con el kit TOPO™ TA Cloning™ (Invitrogen, Carlsbad, California, EE. UU.) utilizando el vector pCR™4-TOPO® y células competentes One Shot® TOP10. Después de la ligación y transformación, las células de Escherichia coli se recuperaron en medio SOC durante 1 h a 37 °C, se sembraron en placas de agar LB y se cultivaron durante 20 h a 37 °C. De cada ensayo de clonación, se seleccionaron de 15 a 20 clones individuales con palitos de dientes esterilizados (flameados) y se transfirieron a placas de agar LB frescas. Los mismos palillos de dientes con E. coli restante se enrollaron en tubos de PCR con 25 µl de mezcla maestra para las PCR de colonias. Las PCR de colonias se realizaron con GoTaq® Long PCR Master Mix (Promega) en las mismas condiciones que las PCR 18S (ver arriba) pero usando los cebadores M13nF (5′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT GA-3′) y M13nR. (5′-GAC CAT GAT TAC GCC AAG CTC-3 ′) [8]. Los productos de PCR de hasta 15 clones que portaban insertos del tamaño esperado se enviaron a Microsynth Austria GmbH (Viena, Austria) para su purificación y secuenciación utilizando los cebadores de PCR de colonias.

Las lecturas directa e inversa y los electroferogramas de las secuencias CytB y 18S se alinearon manualmente y se verificaron visualmente en BioEdit v.7.0.8.0 [13]. Luego, las secuencias se alinearon y ordenaron con MAFFT v.7 [14] usando la opción predeterminada (FFT-NS-2), y las secuencias del cebador y del vector de clonación se cortaron de las alineaciones 18S. Dado que algunos clones 18S no se superpusieron, la parte media se volvió a secuenciar a partir de 65 clones con los cebadores 18S_H_int_F y 18S_H_int_R. Las secuencias 18S larga y corta se combinaron y realinearon con MAFFT v.7. y todas las posiciones aberrantes se volvieron a comprobar en los electroferogramas correspondientes.

Para visualizar la distribución geográfica y de huéspedes de los linajes de H. majoris y H. belopolskyi, se calcularon dos redes de haplotipos de ADN. Los linajes CytB de ambos grupos se agrupan en clados recíprocamente monofiléticos, que actualmente contienen 21 (H. majoris) y 40 (H. belopolskyi) linajes, la mayoría de los cuales aún no se han vinculado a morfoespecies. Los clados se identificaron calculando un árbol de Máxima Verosimilitud (ML) basado en todos los linajes completos de Haemoproteus enumerados en la base de datos MalAvi (http://130.235.244.92/Malavi/index.html) y algunos otros linajes disponibles únicamente en NCBI GenBank. Las secuencias se alinearon con MAFFT v.7. [14] aplicando la opción predeterminada (FFT-NS-2) y los dos primeros y últimos pb se recortaron porque eran erróneos o incompletos en algunas secuencias. Se calculó un árbol de arranque de ML (1000 réplicas) con IQ-TREE v.1.6.12. [15] basado en la alineación recortada de 474 pb (1325 linajes únicos) aplicando el modelo de sustitución GTR+F+I+G4. Para cada linaje contenido en los clados H. majoris y H. belopolskyi, la información sobre huéspedes, países y referencias se extrajo de la tabla “Hosts and Sites” de MalAvi (http://130.235.244.92/Malavi/) y se organizó en una hoja de Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, EE. UU.). Además, se agregaron secuencias e información relacionada para algunos linajes, que solo estaban disponibles en NCBI GenBank. Las redes de haplotipos de unión a la mediana se calcularon con Network 10.2.0.0 (Fluxus Technology Ltd, Suffolk, Reino Unido) utilizando la configuración predeterminada. Las redes se organizaron gráficamente y se les proporcionó información sobre especies/familias hospedantes y regiones geográficas de acuerdo con el geoesquema de las Naciones Unidas con Network Publisher v.2.1.2.5 (Fluxus Technology Ltd). Para mostrar la distribución geográfica y de host de los otros linajes, se crearon gráficos circulares con Microsoft Excel basados en los datos de “Hosts y sitios” de MalAvi. Todos los gráficos se finalizaron con Adobe Illustrator CC v.2015 (Adobe Inc., San José, CA, EE. UU.).

Se calcularon árboles de ML y de inferencia bayesiana (BI) para los conjuntos de datos CytB y 18S. Los árboles CytB se calcularon en base a la alineación de 885 pb de los 19 linajes de MalAvi obtenidos en el presente estudio y ocho linajes publicados por [8]. Se incluyó como grupo externo una secuencia de Plasmodium matutinum pLINN1 (MT912161). El modelo de sustitución de mejor ajuste sugerido por IQ-TREE v.1.6.12. [15] según el Criterio de Información de Akaike corregido (AICc) fue GTR+F+I+G4. El árbol de arranque de ML se calculó con IQ-TREE v.1.6.12. [15] realizando 10.000 réplicas de arranque. El árbol de BI se calculó con MrBayes v.3.2. [dieciséis]. El análisis se realizó durante 5 millones de generaciones (2 ejecuciones cada una con 4 cadenas, una de las cuales se calentó) y se tomaron muestras de cada mil árboles. El primer 25% de los árboles se descartó como quemado y se calculó un árbol de consenso de regla mayoritaria del 50% a partir de los 3750 árboles restantes.

El alineamiento de secuencias 18S contenía 201 clones de 19 linajes MalAvi obtenidos en el presente estudio y 71 clones de siete linajes MalAvi publicados por [8]. Se excluyeron de los análisis trece clones porque se originaban a partir de otros linajes presentes en las coinfecciones. Las secuencias 18S de la muestra AH0002H (hRB1) de [8] también se excluyeron porque carecían de una sección de 115 pb en el extremo 5'. Las secuencias se alinearon con MAFFT v.7. [14] usando la opción G-INS-I (alineación global basada en el algoritmo Needleman-Wunsch). Para reducir el número de secuencias, se seleccionaron subconjuntos de dos a cinco clones distintos por linaje MalAvi (74 secuencias en total). No se incluyó un grupo externo porque las secuencias 18S de otros géneros de hemosporidios difieren mucho de las de Parahaemoproteus spp. y la eliminación de la posición del hueco habría dado lugar a la pérdida de información. El subconjunto de secuencias se realineó con MAFFT v.7. (opción G-INS-I), lo que resulta en una alineación de 2526 pb. Las primeras 65 y las últimas 18 posiciones se eliminaron porque no estaban presentes en las secuencias de las muestras AH1982 (hCOLL3) y AH1895 (hSYAT02) (obtenidas por secuenciación directa) y en la muestra AH0608 (hEMCIR01; [8]). Después de recortar estos últimos sitios, la alineación presentó 2443 posiciones. Después de eliminar todos los sitios que contienen espacios con trimAl v.1.2. [17], la alineación final contó con 1605 posiciones. El modelo de sustitución de mejor ajuste sugerido por IQ-TREE v.1.6.12. [15] según el Criterio de Información de Akaike (AICc) corregido fue TVM+F+I+G4. Dado que este último modelo no está implementado en MrBayes v.3.2. [16], se utilizó el segundo mejor modelo GTR+F+I+G4 para los análisis ML y BI. El bootstrap de ML y los árboles de BI se calcularon con IQ-TREE v.1.6.12. [15] y MrBayes v.3.2. [16] aplicando los mismos parámetros utilizados para inferir los árboles CytB.

Antes del análisis de secuencias, los clones 18S de cada linaje MalAvi se colocaron en archivos separados para determinar las longitudes mínima y máxima de las secuencias. El contenido medio de GC de las secuencias 18S de cada linaje MalAvi se calculó con Microsoft Excel. Las secuencias de cada linaje MalAvi se alinearon por separado con MAFFT v.7. [14] usando la opción G-INS-I, y las distancias p máximas entre las variantes se calcularon con MEGA X v.10.0.5 [18]. Estas últimas alineaciones también se utilizaron para probar si distintos clones 18S de los mismos linajes MalAvi mostraban características quiméricas, lo que indicaba recombinación entre diferentes variantes 18S de los mismos linajes MalAvi. RDP5 v.5.3. [19]) se utilizó para realizar las siguientes pruebas de recombinación: RDP [20], Bootscan [21], GENECONV [22], Maxchi [23], Chimaera [24], SiSscan [25] y 3Seq [26].

Basándose en las alineaciones de todas las secuencias de Haemoproteus 18S, se diseñaron sondas de oligonucleótidos que se dirigen específicamente a los linajes investigados. La alineación se inspeccionó visualmente para identificar regiones adecuadas para la unión de la sonda. La mayoría de las sondas se colocaron en regiones de secuencia variable específicas de cada linaje MalAvi. La calidad de las sondas se comprobó con AmplifX v.2.0.7 (Nicolas Jullien, Aix-Marseille Univ., CNRS, INP, Marsella, Francia; https://inp.univ-amu.fr/en/amplifx-manage- probar y diseñar sus cebadores para pcr). Todas las sondas se bombardearon contra genomas de pájaros y parásitos apicomplejos en NCBI GenBank para excluir la unión no intencionada.

Se analizaron las secuencias 18S de 19 linajes de Parahaemoproteus, la mitad de los cuales pertenecen a los grupos H. majoris y H. belopolskyi. Las secuencias 18S publicadas para siete linajes de Haemoproteus por [8] se incluyeron en los análisis estadísticos y los árboles filogenéticos.

Para visualizar la distribución geográfica y de huéspedes de los linajes CytB pertenecientes a los grupos H. majoris y H. belopolskyi, se calcularon redes de haplotipos de ADN basándose en alineamientos de 474 pb que contienen datos de todos los linajes agrupados en dos clados.

El clado de H. majoris incluía 21 linajes únicos que diferían hasta en nueve pb en la secuencia CytB de 474 pb (Fig. 1). La mayoría de los linajes se encontraron predominantemente en pájaros cantores en Europa y Asia occidental, y ocasionalmente en el norte de África y el sur de Asia, excepto hPOEATR01, hTUMIG08, hTUMIG21 y hPHYBOR04, principalmente de zorzales de América del Norte. Según la base de datos MalAvi (http://130.235.244.92/Malavi/), los siguientes seis linajes fueron atribuidos a H. majoris por [27, 28]: hCCF5, hCWT4, hPARUS1, hPHSIB1, hPHYBOR04 y hWW2. Las secuencias 18S se obtuvieron de todos los últimos linajes excepto hPHYBOR04, porque la única muestra disponible no contenía suficiente ADN. Los tres linajes hPARUS1, hPHSIB1 y hWW2 se encuentran entre los linajes de parásitos hemosporidios más comunes en los pájaros cantores euroasiáticos. hPARUS1 (876 registros) se encontró principalmente en el norte de Europa (510), Europa occidental (135), Europa del este (104), Asia occidental (65) y Europa del sur (48); los principales hospedadores son Cyanistes caeruleus (463) y Parus major (244) de la familia Paridae. hPHSIB1 (868) se encontró principalmente en el norte de Europa (791) y Europa del Este (44); las especies de Muscicapidae Ficedula albicollis (499) y Ficedula hipoleuca (172) son los hospedadores más comunes. hWW2 (505) se encontró principalmente en el norte de Europa (445) y tiene un espectro de huéspedes más amplio con aproximadamente la mitad de los registros de Sylviidae (247), seguido de Phylloscopidae (138), Paridae (55) y Muscicapidae (31); las especies hospedadoras más comunes son Phylloscopus trochilus (108), Sylvia borin (90), Sylvia atricapilla (79) y Sylvia communis (64). hCCF5 (36) se encontró casi exclusivamente en Fringilla coelebs (35) en el norte de Europa (32) y el norte de África (4). hCWT4 (22) se encontró principalmente en el norte de Europa (8), Europa del este (7) y Asia occidental (5), con la mayoría de los registros de Sylviidae (15), particularmente S. communis (8). hEMSPO03 (8) aún no se ha vinculado a ninguna morfoespecie; se encontró en Asia occidental (5), Europa occidental (2) y Europa del este (1) en Pyrrhula pyrrhula (3) y Phylloscopus nitidus (2) y otros. Los registros de hEMSPO03 de Phylloscopus humei (1) y Phylloscopus trochiloides (3) en la India [29] no se incluyeron porque las secuencias cubrían solo 448 pb de la región del código de barras CytB.

Red de haplotipos de ADN de unión media de secuencias CytB parciales (474 pb) pertenecientes al grupo Haemoproteus majoris. Las dos figuras muestran la distribución en familias de aves A y áreas geográficas B según el geoesquema de las Naciones Unidas. Cada círculo representa un haplotipo/linaje único. La frecuencia se indica para todos los haplotipos con más de un registro y corresponde aproximadamente al tamaño de los círculos. Las barras en las ramas indican el número de sustituciones entre dos haplotipos. Los pequeños círculos blancos representan vectores medianos, que son secuencias hipotéticas (a menudo ancestrales o sin muestrear) necesarias para conectar haplotipos existentes con la máxima parsimonia. Los linajes analizados en el presente estudio están marcados con asteriscos.

El clado de H. belopolskyi incluía 40 linajes únicos que diferían hasta en 38 pb en la secuencia CytB de 474 pb (Fig. 2). Por tanto, las distancias entre algunos linajes son mucho mayores que en el clado de H. majoris. Se encontraron casi exclusivamente en varias especies de la familia Acrocephalidae (currucas de los pantanos y de los árboles) en Europa, Asia y África. Según la base de datos MalAvi (http://130.235.244.92/Malavi/), los siguientes nueve linajes pertenecen a H. belopolskyi: hARW1, hHIICT1, hHIICT3, hHIICT4, hHIICT5, hMW1, hRW3, hSW1 y hSW3. Sin embargo, solo se estudiaron morfológicamente HIICT1 y hMW1 [30], y hHIICT5 (diferencia de 1 pb con respecto a hHIICT3) no cubre toda la región del código de barras. El clado también contiene el linaje hGRW01, que fue vinculado a H. nucleocondensus por [31], pero difiere sólo en 2 pb de H. belopolskyi hMW1. Estudios taxonómicos adicionales podrían revelar que los linajes del clado H. belopolskyi pertenecen a múltiples especies crípticas. Las secuencias 18S se obtuvieron de los siguientes cinco linajes: hACDUM2, hARW1, hGRW01, hMW3 y hSW1. hACDUM2 (52 registros) se encontró principalmente en Acrocephalus agricola en Europa del este (22) y Acrocephalus dumetorum en el sur de Asia (22). hARW1 (25) se encontró en Acrocephalus scirpaceus (12), Acrocephalus palustris (5) y algunas otras especies de aves en Europa septentrional, occidental y oriental, Asia occidental y África septentrional y oriental. hGRW01 (225) se detectó casi exclusivamente en Acrocephalus arundinaceus (216) en toda su área de distribución en Europa (195), África (18) y Asia occidental (3). Hasta el momento, hMW3 (6) solo se encontró en A. palustris en Turquía (3) y en el presente estudio en Lituania (2). hSW1 (171) se detectó principalmente en Acrocephalus schoenobaenus (158) en Europa del Este (152), Europa del Norte (2), Europa Occidental (1), Asia Occidental (2) y África Occidental (1), y en A. scirpaceus. (8) en Europa del Este (3), Europa del Sur (2), Asia Occidental (3) y África Occidental (1). Se muestran las distribuciones de los otros linajes (hCCF2, hCCF3, hCCF6, hCOLL3, hCWT7, hEMCIR01, hCULKIB01, hLK03, hROBIN1, hROFI1, hRW1, hSISKIN1, hSTAL2, hTURDUS2 y hSYAT02) en aves huéspedes y áreas geográficas (geoesquema de la ONU) como gráficos circulares (Fig. 3). Haemoproteussp. hCCF2 (95 registros) se encontró principalmente en Fringilla coelebs (81) en el norte de África (52), el norte de Europa (18) y el sur de Europa (16). Haemoproteus fringillae hCCF3 (58) se detectó principalmente en F. coelebs (31), Carduelis chloris (14) y Pyrrhula pyrrhula (7) en el norte de Europa (36), Asia occidental (12), Europa del este (5) y norte de África. (4) y el sur de Europa (1). Haemoproteus cf. magnus hCCF6 (87) se encontró casi exclusivamente en F. coelebs (85) en el norte de África (53), Europa (27), Asia occidental (5) y Asia meridional (2). Se detectó Haemoproteus balmorali hCOLL3 (108) en Ficedula albicollis (76), F. hipoleuca (24) y otros Muscicapidae (9) en el norte de Europa (56), Europa del Este (41), Europa del Sur (7), Asia Occidental ( 2) y el norte de África (1). Haemoproteussp. hCWT7 (29) se encontró principalmente en S. communis (26) en Asia occidental (24). Haemoproteus syrnii hCULKIB01 (22) se encontró en las especies de búhos Strix aluco (10), Strix uralensis (9), Bubo bubo (1) y Strix nebulosa (1) en Europa. Haemoproteus dumbbellus hEMCIR01 (47) se encontró casi exclusivamente en Emberiza citrinella (40) en Europa. Haemoproteus brachiatus hLK03 (19) se encontró principalmente en Falco tinnunculus (13) y otros halcones (2) en Asia oriental (8), Asia occidental (1) y Europa (6). Haemoproteussp. hROFI1 (61) se encontró principalmente en F. coelebs (22), Carduelis chloris (20) y otras especies de Fringillidae (12) en el norte de Europa (38), el norte de África (16), Europa del este (4) y Asia occidental. (3). Haemoproteus attenuatus hROBIN1 (103) se encontró principalmente en las especies de Muscicapidae Erithacus rubecula (40), Luscinia luscinia (34), Luscinia megarhynchos (7) y Saxicola rubetra (7) en Europa y Asia occidental. Haemoproteussp. Se detectó hRW1 (115) en A. scirpaceus (62) y otros Acrocephalidae (4), en Cinclus cinclus (24), Lanius meridionalis (16), Luscinia svecica (8) y Cisticola nigriloris (1) en el sur de Europa (87). ), Europa del Este (12), Europa del Norte (11) y otras regiones (5). Haemoproteus tartakovskyi hSISKIN1 (87) se encontró principalmente en Fringillidae (83) en Centroamérica (37), Norteamérica (22) y Europa (26). Los hospedadores más comunes fueron Haemorhous mexicanus (42), Acanthis flammea (7), Loxia curvirostra (6), Loxia leucoptera (5) en América y Spinus spinus (16) en Europa. Haemoproteus parabelopolskyi hSYAT02 (250) se encontró casi exclusivamente en S. atricapilla (246) en Europa occidental (103), Europa meridional (69), Europa oriental (38), Europa septentrional (30), Asia occidental (8) y África. (2). Haemoproteus syrnii hSTAL2 (37) se detectó en búhos de Europa (36) y el norte de África (1), principalmente en Strix aluco (19) y Strix uralensis (15). Haemoproteus minutus hTURDUS2 (170) se encontró principalmente en Turdidae (140) en Europa (92), Asia occidental (37) y América (14). La mayoría de los registros provienen de Turdus merula (121).

Red de haplotipos de ADN de unión media de secuencias CytB parciales (474 pb) pertenecientes al grupo Haemoproteus belopolskyi. Las dos figuras muestran la distribución en familias de aves A y áreas geográficas B según el geoesquema de las Naciones Unidas. Cada círculo representa un haplotipo/linaje único. La frecuencia se indica para todos los haplotipos con más de un registro y corresponde aproximadamente al tamaño de los círculos. Las barras en las ramas y los números en los cuadrados indican el número de sustituciones entre dos haplotipos. Los pequeños círculos blancos representan vectores medianos, que son secuencias hipotéticas (a menudo ancestrales o sin muestrear) necesarias para conectar haplotipos existentes con la máxima parsimonia. Los linajes analizados en el presente estudio están marcados con asteriscos.

Gráficos circulares que muestran la distribución de linajes de parásitos en áreas geográficas según el geoesquema de las Naciones Unidas (izquierda) y aves huéspedes (derecha)

La información que se muestra en las redes de haplotipos de ADN y los gráficos circulares se resume en el archivo adicional 1: Tabla S1.

En la mayoría de los casos fue necesaria la clonación molecular para recuperar las secuencias 18S porque las variantes diferían en sus longitudes. Sólo las muestras AH1895H (hSYAT02) y AH1982H (hCOLL3) no se clonaron porque sus secuencias 18S eran completamente legibles después de la secuenciación directa. Casi las secuencias 18S completas se clonaron a partir de 20 muestras que presentaban 17 linajes de Haemoproteus. Se secuenciaron de dos a 15 clones por muestra (201 en total, 10,1 clones en promedio). Teníamos la intención de secuenciar hasta 15 clones por linaje, pero el rendimiento de clones fue extremadamente bajo en algunos casos. De los 201 clones, 13 fueron excluidos de los análisis porque se originaron a partir de coinfecciones, que no fueron detectadas al secuenciar la sección del código de barras CytB con los cebadores estándar de [12]. Sin embargo, en algunos casos, las coinfecciones fueron visibles en las secuencias de 885 pb obtenidas con los cebadores CytB_HPL_intF1 y CytB_HPL_intR1 por [8] o en los clones 18S. La mayoría de los clones 18S pudieron asignarse claramente a uno de los linajes de MalAvi porque otras muestras tenían infecciones únicas con los mismos linajes. La muestra AH2168H presentó una infección mixta con los linajes hCCF3 (6 clones), hCCF6 (7 clones) y hCCF5 (2 clones) de los cuales solo los clones hCCF3 se incluyeron en los análisis; los clones de hCCF6 se excluyeron porque las muestras AH2153H y AH2154H contenían infecciones únicas con el mismo linaje, y los dos clones de hCCF5 se excluyeron porque las partes medias de las secuencias eran ilegibles. La muestra AH1973H presentó una coinfección con los linajes hCCF3 (9 clones), hCCF5 (2 clones) y hROFI1 (1 clon). El clon hROFI1 se excluyó de los análisis porque la muestra AH2171H proporcionó suficientes clones del linaje hROFI1, pero los dos clones hCCF5 se mantuvieron porque eran las únicas secuencias 18S completas de este linaje. La muestra AH2171H contenía una coinfección con hROFI1 (12 clones) y hCCF6 (3 clones); los clones de hCCF6 se excluyeron de los análisis porque había suficientes clones de hCCF6 disponibles en las muestras AH2153H y AH2154H. Además, la muestra AH1664H probablemente contenía una coinfección con hSW1 y otro linaje de H. belopolskyi. La muestra presentaba cuatro clones (3, 5, 6, 14) que se parecían mucho a los de H. belopolskyi hARW1 (AH1903H) y hMW3 (AH1899 y AH1902), y siete clones (2, 4, 7, 8, 10, 11, 12). ) formando una rama separada dentro del clado H. belopolskyi. Los primeros cuatro clones podrían pertenecer al linaje hSW3, que se encontró exclusivamente en la misma especie huésped (A. schoenobaenus) y difiere solo en un pb de hARW1 (Fig. 2). Los picos dobles en los electroferogramas del fragmento CytB de 885 pb coincidían con el linaje hSW3, pero eran demasiado débiles para confirmar claramente su presencia. Además de AH1973H, AH2168H, AH2171H y AH1664H, las otras muestras probablemente contenían monoinfecciones con clones 18S pertenecientes a linajes de parásitos únicos. Las secuencias 18S de H. majoris hEMSPO03 (AH2023H) no se pudieron recuperar por completo porque presentaban motivos poli-A y poli-T desde la posición 1660 a 1800. Las secuencias 18S se cargaron en NCBI GenBank con los números de acceso OR337936–OR338136. Las secciones de 885 pb del CytB mitocondrial se depositaron con los números de acceso OR283176 – OR283196.

Los árboles filogenéticos se calcularon con las secuencias 18S y CytB del presente estudio y las publicadas por [8]. El árbol 18S (Fig. 4), que contiene una selección de dos a cinco clones 18S distintos por linaje MalAvi (74 secuencias en total), tenía raíces en el punto medio. El árbol CytB (Fig. 5) se calculó con las secuencias de 885 pb y se enraizó con una secuencia de Plasmodium matutinum pLINN1. Los nodos más profundos obtuvieron valores de soporte bajos en ambos árboles y la topología difirió parcialmente, pero los árboles 18S y CytB compartieron algunos patrones comunes. Los linajes H. brachiatus hLK03, H. minutus hTURDUS2, H. syrnii hCULKIB01 y H. syrnii hSTAL2 toman posiciones más basales en los árboles, mientras que los otros linajes se agrupan en un clado con bajo (18S; bs/bp = 72/ 0,76) y apoyo moderado (CytB; bs/pp = 82/0,98). El último clado presentaba cuatro subclados con gran apoyo en ambos árboles. El primer subclado incluye H. dumbbellus hEMCIR01, H. fringillae hCCF3, Haemoproteus sp. hROFI1, H. tartakovskyi hSISKIN1 y Haemoproteus sp. hCCF2. El segundo subclado incluye H. balmorali hCOLL3 y H. attenuatus hROBIN1. El tercer subclado presenta los linajes de H. majoris hCCF5, hPARUS1, hWW2, hCWT4, hPHSIB1 y hEMSPO03 (aún no vinculados a una morfoespecie). El cuarto subclado incluye el grupo de cuatro linajes de H. belopolskyi hMW3, hARW1, hSW1, hACDUM2, H. nucleocondensus hGRW01 y los linajes H. parabelopolskyi hSYAT02, H. payevskyi hRW1, H. cf. magnus hCCF6 y H. sp. hCWT7. Los clones 18S de la mayoría de los linajes se agruparon en clados recíprocamente monofiléticos. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, los clones de la muestra AH1664H probablemente pertenecen a dos linajes de Haemoproteus diferentes (hSW1 y hSW3).

Árbol de inferencia bayesiano de secuencias de Haemoproteus 18S. Las probabilidades posteriores y los valores de arranque de máxima verosimilitud se indican en la mayoría de los nodos. La barra de escala indica el número medio esperado de sustituciones por sitio según el modelo de evolución de secuencia aplicado. El árbol tenía raíces en el punto medio, no se utilizó ningún grupo externo.

Árbol de inferencia bayesiano de secuencias de Haemoproteus CytB (885 pb). Las probabilidades posteriores y los valores de arranque de máxima verosimilitud se indican en la mayoría de los nodos. La barra de escala indica el número medio esperado de sustituciones por sitio según el modelo de evolución de secuencia aplicado. El árbol fue enraizado con una secuencia de Plasmodium matutinum pLINN1.

Las distancias p entre las variantes 18S de los 27 linajes de Parahaemoproteus oscilaron entre el 0,46% en H. lanii hRB1 y el 20,54% en H. tartakovskyi hSISKIN1 (Tabla 2). Este último linaje es excepcional porque presentaba dos variantes 18S similares y una tercera muy divergente. Excluyendo esta muestra, la distancia p máxima media entre clones 18S de los otros linajes fue del 1,84%. Como se mencionó anteriormente, algunos clones de la muestra AH1664H podrían pertenecer a hSW3 (no confirmado) en la coinfección. Al probar los dos grupos de secuencias por separado, las distancias p máximas entre los clones de hSW1 y hSW3 fueron menores con 1,26 y 0,73, respectivamente (Tabla 2).

Las longitudes totales aproximadas de las secuencias 18S (incluidas las partes faltantes y las regiones del cebador) oscilaron entre 1943 pb en H. minutus hTURDUS2 y 2278 pb en H. majoris hCCF5. Las mayores diferencias entre las secuencias 18S más cortas y más largas se encontraron en H. tartakovskyi hSISKIN1 con 53 pb y en H. fringillae hCCF3 con 40 pb; la diferencia media entre los 27 linajes de Parahaemoproteus fue de 6,8 pb. Los contenidos de GC oscilaron entre el 39,4% en H. tartakovskyi hSISKIN1 y el 47,4% en H. syrnii hSTAL2; la media global fue del 45,2% (Tabla 2). Curiosamente, H. tartakovskyi hSISKIN1 presentó tres clones 18S con 42,7% (ramas cortas en la Fig. 4) y siete clones con 37,4% de contenido de GC (rama larga en la Fig. 4).

Las pruebas de señales recombinantes se realizaron por separado para las alineaciones de clones 18S de cada linaje Parahaemoproteus utilizando RDP5 [19]. Se detectaron señales recombinantes en diez de los 27 linajes investigados, incluidos H. fringillae hCCF3, Haemoproteus sp. hROFI1, H. nucleocondensus hGRW01, H. syrnii hCULKIB01, H. syrnii hSTAL2, H. tartakovskyi hSISKIN1 y los linajes de H. majoris hCWT4, hPHSIB1, hPARUS1 y hWW2 (Tabla 2). Las señales de recombinación más fuertes se detectaron en hPHSIB1, hWW2 y hCCF3 y cada cinco o más de las siete pruebas proporcionaron resultados significativos (archivo adicional 2: Tabla S2).

Con base en la alineación que contiene todas las secuencias de Haemoproteus 18S disponibles, se diseñaron sondas de oligonucleótidos para apuntar específicamente al ARNr 18S de los linajes investigados en este estudio. Las secuencias 18S de la mayoría de los linajes de Haemoproteus presentaban regiones de secuencia únicas, a las que se podían dirigir sondas de oligonucleótidos mediante hibridación in situ (Tabla 3). Sin embargo, las secuencias 18S de los linajes hARW1, hMW3 y hSW3 de H. belopolskyi eran demasiado similares y se diseñó una sonda dirigida a los tres linajes en paralelo. La sonda diseñada para el linaje hROFI1 solo se dirige a una de las dos variantes principales (C02, C08, C09, C11); la sonda ya fue probada, confirmando la expresión en las aves huéspedes (resultados no publicados). Las longitudes de las sondas y las temperaturas de recocido oscilaron entre 23 y 31 nucleótidos y 54,2 °C y 68,1 °C, respectivamente. La mayoría de las sondas obtuvieron una puntuación de calidad máxima (100) en AmplifX v.2.0.7.

Para el presente estudio, se secuenciaron los genes 18S rRNA de 19 linajes de Haemoproteus, todos pertenecientes al subgénero Parahaemoproteus. Más de la mitad de estos linajes estaban previamente vinculados o están estrechamente relacionados con los grupos de especies de H. majoris (hCCF5, hCWT4, hEMSPO03, hPARUS1, hPHSIB1, hWW2) y H. belopolskyi (hACDUM2, hARW1, hMW3, hGRW01, hSW1) basados en sobre caracteres morfológicos de sus estadios sanguíneos y/o secuencias de códigos de barras CytB similares. Los dos grupos de especies incluyen algunos de los linajes de Haemoproteus más comunes que se encuentran en aves canoras de la región Paleártica. Además, se secuenciaron los genes de ARNr 18S de otros ocho linajes de Haemoproteus: hCOLL3, hCCF2, hCCF3, hCCF6, hCWT7, hROFI1, hRW1 y hSYAT02. En los análisis de secuencia se incluyeron los datos sobre ocho linajes de Haemoproteus publicados por [8], hCULKIB01, hEMCIR01, hLK03, hROBIN1, hRB1, hSISKIN1, hSTAL2 y hTURDUS2.

La mayoría de las especies de Plasmodium de mamíferos presentan dos grupos de secuencias muy divergentes, cada uno de los cuales contiene una o dos variantes de 18S similares. Se demostró que las variantes 18S de Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax y Plasmodium berghei se expresan diferencialmente en los huéspedes vertebrados (tipo A) y en los mosquitos vectores (tipo S) [32,33,34]. Plasmodium vivax es la única especie con una variante adicional de tipo O, que se expresa en los ookinetes y ooquistes [33]. Otra excepción es Plasmodium malariae porque sus genes 18S son casi idénticos y no forman grupos separados. Las distancias entre las variantes 18S también fueron comparativamente altas en Plasmodium vaughani pSYAT05 (9,3%), Plasmodium matutinum pLINN1 (10,8%) y Plasmodium elongatum pGRW06 (14,9%) [8]. Las pruebas de recombinación detectaron características quiméricas en las secuencias 18S de varias especies de Plasmodium, lo que sugiere que las distintas variantes no evolucionan de forma independiente según un modelo de evolución de nacimiento y muerte bajo una fuerte selección purificadora [4] sino más bien de una manera semiconcertada [8 , 35].

Los parásitos Haemoproteus estudiados también presentaban distintas variantes de 18S, pero las distancias máximas promedio entre las variantes fueron considerablemente más bajas (media de 1,84% excluyendo el aberrante H. tartakovskyi hSISKIN1) que en la mayoría de las especies de Plasmodium investigadas. A diferencia de muchas especies de Plasmodium, las variantes 18S de la mayoría de los linajes se agruparon en clados recíprocamente monofiléticos. Una excepción fue la muestra AH1664H, cuyas variantes 18S diferían en un 5,64% y se dividían en clados separados dentro del grupo H. belopolskyi; sin embargo, la última muestra probablemente presentaba una coinfección con H. belopolskyi hSW3 y H. belopolskyi hSW1 (consulte “Resultados ”). Haemoproteussp. hROFI1 presentó dos variantes de 18S que divergieron en un 7,5%, pero se agruparon en un clado débilmente soportado (Fig. 4); Aparte de los picos dobles que coinciden con hCCF6 en las secuencias largas de CytB, no se identificó ningún otro linaje en la coinfección. Los patrones más excepcionales se encontraron en H. tartakovskyi hSISKIN1, que presentaba tres variantes 18S, dos similares separadas por un 6,5% y una tercera separada de estas dos últimas por un 18,3% y un 20,5%, respectivamente. La tercera variante mostró un gran número de sustituciones (principalmente cambios de G/C a A/T) en regiones de secuencia, que estaban conservadas en la mayoría de los demás linajes de Haemoproteus, por lo que su contenido de GC fue considerablemente menor con un 37,4 % en comparación con el de las otras. variantes con 43,2% y 42,4%. Esta variante aberrante de 18S podría no ser funcional y, por lo tanto, adquirió un número mucho mayor de sustituciones en comparación con otras copias de los genes de ARNr 18S de Haemoproteus. A pesar de la alta divergencia de secuencia, las tres variantes se agruparon en un clado bien soportado (Fig. 4). Las secuencias del genoma nuclear de H. tartakovskyi hSISKIN1 publicadas por Bensch et al. [36] también incluyeron la tercera variante aberrante (PRJNA309868, contig 65), pero solo una de las otras dos (PRJNA309868, contig 602). El contenido medio de GC de todas las secuencias de Haemoproteus 18S analizadas fue del 45,2%, que es considerablemente mayor que el de Plasmodium spp. con 34,0% y Leucocytozoon spp. común. con el 37,3%. El contenido de GC fue sólo mayor en los linajes de parásitos pertenecientes al grupo de especies Leucocytozoon toddi con un 49,3% [8]. Las longitudes totales aproximadas de las secuencias de Haemoproteus 18S oscilaron entre 1943 pb en H. minutus hTURDUS2 y 2278 pb en H. majoris hCCF5 y, por lo tanto, fueron más variables que en Plasmodium spp. (2100 a 2177 pb), Leucocytozoon spp. (2094 a 2138 pb) y el grupo de especies Leucocytozoon toddi (2125 a 2308 pb). Las pruebas de recombinación realizadas con las secuencias 18S de los linajes del parásito Haemoproteus también indicaron características quiméricas potencialmente resultantes de la recombinación entre variantes 18S de la misma especie o linaje. Los resultados difirieron entre especies, por ejemplo, no se detectaron variantes de 18S recombinantes en el grupo de H. belopolskyi en comparación con el grupo de H. majoris, con cuatro de cinco linajes que presentaban variantes recombinantes. Por lo tanto, los resultados sugieren que los genes ribosómicos nucleares de las especies de Haemoproteus evolucionan más bien de forma semiconcertada, como sugirieron Corredor y Enea para varias especies de Plasmodium [35], que según un modelo de evolución de nacimiento y muerte propuesto por Rooney. [4]. Corredor y Enea [35] utilizaron el término evolución semiconcertada porque encontraron que algunas (pero no todas) las copias del gen 18S rRNA de Plasmodium spp. evolucionan en concierto, por lo que requieren alguna forma de interacción de secuencia (conversión) distinta del cruce desigual. Por el contrario, los genes ribosómicos de la mayoría de los eucariotas evolucionan de forma totalmente concertada, lo que lleva a la homogeneización de copias de genes individuales [3], lo que implica mecanismos como el cruce desigual durante la recombinación, la duplicación de genes y la conversión de genes intercromosómicos [1, 2]. , 37]. Por otro lado, el modelo de evolución de nacimiento y muerte supone que las familias multigénicas involucradas en el sistema inmunológico, como las inmunoglobulinas y el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), no evolucionan de manera concertada; Las nuevas copias se originan por duplicación de genes, mientras que otras dejan de funcionar y se eliminan con el tiempo [38, 39].

El gen 18S rRNA se ha utilizado como secuencia de referencia estándar para detectar parásitos apicomplejos y determinar sus relaciones filogenéticas. Sin embargo, debido a la presencia de variantes distintas y la recombinación entre ellas, inserciones/deleciones largas y contenidos de GC que varían fuertemente entre géneros/subgéneros, las secuencias 18S de los parásitos hemosporidios son menos adecuadas como marcador filogenético que en otros grupos de parásitos apicomplejos. (p. ej., Eucoccidiorida, Piroplasmorida y Eugregarinorida), que en su mayoría poseen copias idénticas y más conservadas de genes ribosómicos nucleares. Por lo tanto, los ensayos de detección por PCR para especies de Plasmodium humanas solo se dirigen a una de las principales variantes de 18S [40, 41]. Enfoques más recientes incluso establecieron una PCR de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) para apuntar directamente al ARNr 18S, lo que resulta en una sensibilidad aún mayor [42, 43]. Estos enfoques son prácticos para detectar infecciones humanas por Plasmodium porque comprenden sólo cuatro especies, pero menos adecuados para detectar parásitos hemosporidios de aves silvestres porque incluyen un número mucho mayor de especies y obtener sus secuencias 18S requeriría clonación molecular o el uso de Métodos de secuenciación de próxima generación.

Sin embargo, el 18S y otros genes de ARN ribosomal nuclear, respectivamente los ARN ribosómicos correspondientes, son objetivos extremadamente útiles para ensayos de hibridación in situ para marcar parásitos en el tejido huésped. Esto abre nuevas perspectivas para la investigación de patología al centrarse en ciertas especies/linajes de parásitos durante la hemoproteosis aviar, que puede dañar notablemente varios órganos de las aves, pero que aún no se ha investigado lo suficiente [44, 45]. Una de las principales ventajas en comparación con otras secuencias diana es que cada célula contiene numerosos ribosomas, lo que resulta en una mayor sensibilidad. Además, los ARN ribosómicos son considerablemente más estables que otros ARN, lo que es particularmente importante cuando se analizan muestras patológicas que no se prepararon a partir de material fresco [46]. Se han establecido sondas de oligonucleótidos específicas de género para la hibridación in situ para apuntar y diferenciar entre los parásitos aviares Plasmodium, Haemoproteus y Leucocytozoon en el tejido de las aves [47, 48]. Se utilizó con éxito una sonda específica de Plasmodium para detectar estadios sanguíneos y tisulares en órganos incluidos en parafina de pingüinos cautivos y aves paseriformes salvajes, lo que demuestra que los estadios tisulares de Plasmodium spp. puede causar mortalidad en ambos grupos [47, 49]. También se han realizado ensayos de hibridación cromogénica in situ para caracterizar merones tisulares en aves rapaces accipitriformes [50], aves rapaces estrigiformes [51], zorzales [52] y otras aves canoras [11]. Estos últimos estudios proporcionaron información valiosa sobre el desarrollo de estadios del parásito exoeritrocítico en el tejido del huésped. Por ejemplo, la combinación de métodos histológicos e hibridación in situ condujo al primer informe de megalomerontes en Haemoproteus syrnii hSTAL2 y a la caracterización de un nuevo modo de desarrollo exoeritrocítico en Leucocytozoon sp. ISTAL5 [51]. Las nuevas secuencias y sondas de oligonucleótidos de Haemoproteus 18S podrían usarse para apuntar específicamente a ciertos linajes/especies de parásitos en el tejido huésped. Esto es particularmente importante y sigue siendo el único enfoque disponible cuando las muestras contienen coinfecciones, que predominan en la vida silvestre.

Para el presente estudio, se secuenciaron los genes 18S rRNA de 19 linajes de Haemoproteus pertenecientes al subgénero Parahaemoproteus, los parásitos sanguíneos más comunes de las aves del Paleártico, centrándose así en los grupos de especies H. belopolskyi y H. majoris. Las secuencias 18S de ocho especies adicionales de Haemoproteus, publicadas previamente por Harl et al. [8], se incluyeron en los análisis. Para mostrar la distribución geográfica y de huéspedes de los linajes investigados, se prepararon redes de haplotipos de ADN y gráficos circulares basados en los datos de CytB disponibles en la base de datos MalAvi. Como la mayoría de los parásitos Plasmodium, los linajes Haemoproteus también presentaban dos o más variantes 18S, pero las distancias intraespecíficas entre variantes de los mismos linajes eran generalmente menores. Además, las secuencias 18S de todos los linajes de parásitos excepto uno se agruparon en clados recíprocamente monofiléticos, lo que no fue el caso de la mayoría de las especies de Plasmodium de mamíferos y aves. La presencia de características quiméricas en las variantes 18S de más de un tercio de los linajes Haemoproteus indica que sus unidades ribosómicas evolucionan de forma semiconcertada en lugar de seguir un modelo estricto de evolución de nacimiento y muerte. Sobre la base de una alineación de las secuencias 18S, se diseñaron sondas de oligonucleótidos in silico, que podrían usarse para apuntar específicamente a especies/linajes de parásitos en el tejido huésped con métodos de hibridación in situ cromogénicos o fluorescentes. Esto permitiría detectar ciertos linajes de parásitos incluso en muestras con coinfecciones, que son extremadamente comunes en los pájaros cantores.

Los datos de las secuencias 18S y CytB se depositaron en NCBI GenBank con los siguientes números de acceso: OR337936 – OR338136 (18S) y OR283176 – OR283196 (CytB).

Gen del ARN ribosómico 18S

Gen del citocromo B

subunidad ribosómica pequeña

subunidad ribosómica grande

Criterio de información de Akaike corregido

affinis (la especie propuesta está relacionada pero no es idéntica a la especie de este nombre binomial

El linaje está genéticamente estrechamente relacionado con la especie nombrada, pero su morfología aún no ha sido estudiada)

conferatur (comparar con las especies nombradas)

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Los autores agradecen a la Dra. Tatjana A. Iezhova y al Dr. Ivan Maggini por participar en el trabajo de campo y ayudar en la recolección de muestras de sangre.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por el Fondo Austriaco para la Ciencia (FWF). Esta investigación fue financiada por el Fondo Austriaco para la Ciencia (FWF) [P 33480]. A los efectos del acceso abierto, el autor ha aplicado una licencia pública de derechos de autor CC BY a cualquier versión del manuscrito aceptado por el autor que surja de este envío.

Departamento de Patobiología, Instituto de Patología, Universidad de Medicina Veterinaria de Viena, Viena, Austria

Josef Harl, Tanja Himmel y Herbert Weissenböck

Centro de investigación de la naturaleza, Vilna, Lituania

Mikas Ilgunas y Gediminas Valkiūnas

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JH, TH, HW: concepción y diseño del estudio; JH: redacción del borrador original; MI, TH, JH: recogida de muestras de sangre y tejidos; JH: trabajos de laboratorio y análisis genéticos moleculares; GV, TH, HW: revisión y edición; HW: administración de proyectos y adquisición de financiación. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Josef Harl.

Agencia de Protección Ambiental de Lituania (Permisos 2018-04-13, No. 24; 2019-04-19, No. 23; 2020-04-07, No. 21; 2021-05-05, No. 26-SR- 96) aprobó el muestreo selectivo de aves por parte del Centro de Investigación de la Naturaleza de Vilnius. La recogida de muestras de sangre de aves en Austria fue aprobada por el comité institucional de ética y bienestar animal y por la autoridad nacional según el artículo 26 y siguientes. de las Leyes de Experimentación con Animales, Tierversuchsgesetz 2012-TVG 2012, Austria (BMWFW‑68.205/0036‑WF/V/3b/2017), y se tomaron muestras de tejido de cadáveres presentados para exámenes patológicos de rutina.

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

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Datos de secuencia de CytB utilizados para las redes de haplotipos de ADN y gráficos circulares que muestran la distribución de linajes de Haemoproteus en aves hospedadoras y regiones geográficas.

Resultados de las pruebas de recombinación de RDP5 analizando las secuencias 18S de los linajes de Haemoproteus estudiados.

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Reimpresiones y permisos

Harl, J., Himmel, T., Ilgūnas, M. et al. Los genes 18S rRNA de los parásitos Haemoproteus (Haemosporida, Apicomplexa) de pájaros cantores europeos con comentarios sobre diagnósticos mejorados de parásitos. Malar J 22, 232 (2023). https://doi.org/10.1186/s12936-023-04661-9

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Recibido: 19 de abril de 2023

Aceptado: 27 de julio de 2023

Publicado: 10 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12936-023-04661-9

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