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Parásitos y vectores volumen 16, número de artículo: 282 (2023) Citar este artículo

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La leishmaniasis es una enfermedad zoonótica endémica de la región mediterránea donde Leishmania infantum es el agente causante de la infección humana y canina. La caracterización de este parásito a nivel de subespecie puede ser útil en estudios epidemiológicos, para evaluar el curso clínico de la enfermedad (por ejemplo, cepas resistentes, formas viscerales y cutáneas de leishmaniasis), así como para identificar reservorios de infección. La electroforesis enzimática multilocus (MLEE), un método actualmente reconocido como método de referencia para caracterizar e identificar cepas de Leishmania, es engorrosa, requiere mucho tiempo y requiere cultivos de parásitos. Estas desventajas han llevado al desarrollo de otros métodos, como la tipificación de microsatélites multilocus (MLMT) y la tipificación de secuencias multilocus (MLST), para tipificar parásitos Leishmania; sin embargo, estos métodos aún no se han aplicado de forma rutinaria. En este estudio, primero utilizamos MLST para identificar polimorfismos informativos en genes de copia única que codifican enzimas metabólicas, luego de lo cual desarrollamos dos ensayos rápidos de genotipado basados ​​en análisis de fusión de alta resolución (HRM) para explorar estos polimorfismos en parásitos L. infantum.

Se diseñó un panel de secuenciación personalizado dirigido a 14 genes constitutivos y se realizó un análisis MLST en nueve cepas/aislamientos caninos y humanos de L. infantum. Se diseñaron dos ensayos cuantitativos de PCR-HRM en tiempo real para analizar dos polimorfismos informativos en los genes de la enzima málica (ME) y de la glucosa-6-fosfato isomerasa (GPI) (390T/G y 1831A/G, respectivamente). Los dos ensayos se aplicaron a 73 muestras/aislamientos clínicos del centro y sur de Italia y la isla de Pantelleria, y los resultados se confirmaron mediante secuenciación de ADN en un subconjunto de muestras.

El análisis MLST, junto con secuencias disponibles en la base de datos Genbank, permitió identificar dos polimorfismos informativos en los genes que codifican ME y GPI. La detección rápida de estos polimorfismos utilizando dos ensayos basados ​​en HRM en 73 muestras/aislamientos clínicos dio como resultado la identificación de siete genotipos. En general, el genotipo 1 (tipo de secuencia 390T/1831G) fue el más representado (45,2%) en la muestra general y se correlacionó con los zimodemas de L. infantum más comunes (MON-1, MON-72). Curiosamente, en la isla Pantelleria, el genotipo más prevalente (70,6%) fue el genotipo 6 (tipo de secuencia 390T/1831A).

La aplicación de nuestros ensayos HRM en muestras clínicas nos permitió identificar siete genotipos diferentes sin la necesidad de aislamiento y cultivo de parásitos. Hemos demostrado que estos ensayos podrían utilizarse como herramientas rápidas, rutinarias y económicas para la vigilancia epidemiológica de L. infantum o para la identificación de nuevos reservorios de infección.

La leishmaniasis es una enfermedad zoonótica endémica de la cuenca mediterránea causada principalmente por Leishmania infantum, agente etiológico de la leishmaniasis cutánea y visceral humana (CL y VL, respectivamente), así como de la leishmaniasis canina (CanL). La caracterización de Leishmania se realiza tradicionalmente mediante electroforesis enzimática multilocus (MLEE), que actualmente la OMS todavía considera como el método de referencia para la tipificación de parásitos [1]. MLEE, que fue desarrollado en el Centro de Leishmaniasis de Montpellier (Francia) (sistema MON), se basa en las diferentes movilidades electroforéticas de 15 enzimas metabólicas: malato deshidrogenasa (MDH), enzima málica (ME), isocitrato deshidrogenasa (ICD), 6-fosfogluconato deshidrogenasa (PGD), glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD), glutamato deshidrogenasa (GLUD), NADH diaforasa (DIA), purina nucleósido fosforilasa 1 (NP1), purina nucleósido fosforilasa 2 (NP2), transaminasas glutamato-oxalacetato 1 y 2 (GOT1, GOT2), fosfoglucomutasa (PGM), fumarato hidratasa (FH), manosa-fosfato isomerasa (MPI) y glucosa-6-fosfato isomerasa (GPI) [2]. La comparación de la movilidad de las isoenzimas con una cepa de referencia ha llevado a la identificación de > 300 zimodemas, todos denominados utilizando términos MON. Respecto a L. infantum, se han identificado 45 zimodemas. La LV y la LV zoonóticas son causadas principalmente por MON-1, MON-24, MON-34, MON-72, MON-77, MON-80, MON-98, MON-105, MON-108, MON-199 y MON. -199 variante NP1130 y MON-281. En particular, MON-1 es el zimodema más frecuente en humanos y perros [3, 4], seguido de MON-72, que es más difuso en CanL pero que también se ha identificado en pacientes humanos [5]. Por el contrario, algunos zimodemas (es decir, MON-11, MON-27, MON-28, MON-29, MON-33, MON-189) se han aislado sólo en humanos [6]. Además, se han informado varios parásitos distintos de MON-1 en pacientes con VIH [7]. Estos hallazgos ponen en duda el papel de los perros, históricamente considerados el principal reservorio de infección para los humanos, en la transmisión de la enfermedad. De hecho, la homogeneidad de los zimodemas identificados en la población canina no refleja la heterogeneidad de los encontrados en humanos.

La caracterización de Leishmania basada en MLEE tiene una serie de limitaciones: requiere mucho tiempo y es engorrosa, requiere aislamiento y cultivo del parásito y sólo puede realizarse en unos pocos laboratorios. Para superar estos desafíos, se han propuesto varios enfoques biomoleculares, incluida la tipificación de secuencias multilocus (MLST) [8] y la tipificación de microsatélites multilocus (MLMT) [9]. Sin embargo, a pesar de la solidez del resultado MLST, la aplicación de este método directamente a muestras clínicas es difícil debido a su sensibilidad limitada: se basa principalmente en genes de copia única. Además, amplificar varios genes en paralelo y secuenciarlos es costoso y requiere mucho tiempo. En comparación, MLMT se ha utilizado en muestras clínicas [9], pero el método requiere varias amplificaciones por PCR y análisis de electroforesis en gel capilar. En resumen, estas dos técnicas requieren mucho tiempo y son relativamente costosas, y pueden requerir el aislamiento del parásito; por lo tanto, su aplicabilidad en estudios epidemiológicos y rutinas clínicas puede resultar un desafío.

En este contexto, en un estudio anterior desarrollamos un enfoque alternativo basado en un ensayo de fusión de alta resolución (HRM) para diferenciar los zimodemas más comunes (es decir, MON-1, MON-72, MON-201 [excepto MHOM/TN/ 80/IPT1, un zimodema MON-1 de Túnez]) que explota el polimorfismo 390T>G en el gen de la enzima málica (ME), evidenciando una concordancia parcial, aunque no unívoca, entre los resultados del genotipado y los resultados de MLEE [10]. En el presente estudio, que representa una extensión del anterior, diseñamos un panel MLST en 14 genes que codifican enzimas utilizadas para MLEE con los objetivos: (i) identificar más polimorfismos útiles para la tipificación de L. infantum; y (ii) desarrollar y aplicar pruebas basadas en HRM sobre los polimorfismos más informativos para implementar la caracterización rápida y económica de cepas de L. infantum.

Las cepas, aislados y muestras clínicas de Leishmania infantum analizadas en este estudio se enumeran en la Tabla 1. Las muestras clínicas consistieron en sangre periférica (obtenida por venopunción en tubos con EDTA); capa leucocitaria (es decir, glóbulos blancos recogidos después de centrifugación de sangre completa a 210 g durante 10 min); aspirados con aguja de médula ósea y ganglios linfáticos (obtenidos en tubos con EDTA para extracción de sangre); raspados de piel y biopsia de piel de lesiones cutáneas (obtenidas utilizando un hisopo de algodón estéril y un punzón de biopsia, respectivamente) recolectadas en tubos estériles que contienen solución salina tamponada con fosfato (PBS); e hisopos conjuntivales (es decir, células epiteliales exfoliativas recogidas del saco conjuntival inferior utilizando hisopos de algodón esterilizados). Los aislados clínicos se obtuvieron de aspirados de ganglios linfáticos frescos o de biopsias de piel, como se describió anteriormente [11]. Se recolectaron muestras clínicas y aislamientos entre 2015 y 2021 en el centro y sur de Italia; entre ellos, una fracción procedía de una población canina residente en una perrera en la isla de Pantelleria, una pequeña isla (80 km2) situada al suroeste de Sicilia y a 60 km al este de la costa tunecina.

Los números de muestra 13–26, 41–60 y 66–93 (Tabla 1) fueron proporcionados por el Centro Nacional de Referencia del Laboratorio de Referencia de la OIE para la Leishmaniasis (C.Re.Na.L.) (Palermo, Italia) [12, 13]. Se obtuvieron muestras humanas adicionales (núms. 27, 61–65; Tabla 1) de la Unidad de Enfermedades Infecciosas del Hospital Marche Nord (Pesaro, Italia). El aislamiento del parásito de la muestra 27 (Tabla 1) se realizó como se describió anteriormente [14, 15]. Las muestras clínicas caninas (núms. 28 a 40; Tabla 1) fueron proporcionadas por la clínica veterinaria "Santa Teresa" en Fano (región de Las Marcas, Italia). Todas las muestras se recolectaron como parte del procedimiento de diagnóstico durante el examen de rutina, con excepción de los hisopos conjuntivales, que se recolectaron con fines de investigación (consulte la declaración de aprobación ética y consentimiento para participar al final del artículo).

Todas las muestras humanas y veterinarias fueron diagnosticadas como positivas para Leishmania spp. mediante evaluación objetiva, pruebas serológicas [es decir, IFAT, pruebas SNAP (Laboratorios IDEXX, Westbrook, ME, EE. UU.) o la prueba Speed ​​Leish K (BVT Groupe Virbac, La Seyne sur Mer, Francia)] y/o mediante examen citohistológico. Además, después de la extracción del ADN (consulte la siguiente sección), la positividad de la muestra se evaluó con análisis qPCR-ML [16]. Para confirmar la presencia de especies de L. infantum, la identificación molecular se realizó con una prueba basada en qPCR [17] o con un polimorfismo de longitud de fragmento de restricción de 1-PCR del espaciador del transcriptor interno (ITS1-PCR RFLP) según Schönian et al. [18]. Brevemente, los productos de la PCR se digirieron con 10 U de HaeIII (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) a 37 °C durante 3 h. Los fragmentos de restricción se visualizaron en gel de agarosa MetaPhor (Cambrex Corp., East Rutherford, Nueva Jersey, EE. UU.) de alta resolución al 3,5 %.

El ADN de los parásitos cultivados (cepas de referencia o aislados clínicos) y de las muestras clínicas (a excepción de los hisopos conjuntivales) se extrajo utilizando el kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante, y posteriormente se cuantificó mediante un fluorómetro Qubit. (Tecnologías de la vida, Thermo Fisher Scientific). El ADN de hisopos conjuntivales se obtuvo a partir de lisados ​​crudos como se describió anteriormente [19]. Brevemente, los hisopos se incubaron durante 2 h a 56 ° C en 200 μl de tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, Nonidet P40 al 0,5%, Tween 20 al 0,5%, proteinasa K 0,1 mg/ml). Después de la eliminación con hisopo, las muestras se incubaron durante 10 min a 95 °C y se centrifugaron a 10.000 g durante 10 min.

Se seleccionaron un total de 14 genes codificadores de proteínas para el ensayo MLST: factor de iniciación de elongación 2alfa, espermidina sintasa 1, ICD, GPI, nucleósido hidrolasa de inosina-guanina, nucleósido hidrolasa no específica, ME, fosfomanosa isomerasa, G6PD, malato deshidrogenasa, arginasa, 6-fosfogluconato deshidrogenasa, fosfomanomutasa y UDP-N-acetilglucosamina-dolichil-fosfato N-acetilglucosaminafosfotransferasa. Se diseñó un panel de secuenciación personalizado con la herramienta Ion AmpliSeq™ Designer v7.0.6 (Thermo Fisher Scientific), utilizando el genoma JPCM5 de L. infantum (ensamblaje GCA_900180445.1) como referencia (archivo adicional 1: Tabla S1). Este panel constaba de dos grupos de cebadores con 88 amplicones diferentes. Las nueve cepas/aislamientos de Leishmania secuenciados se muestran en la Tabla 1 (superíndice '2': 5 aislamientos caninos de la isla Pantelleria y el centro de Italia, y 4 aislados/cepas humanos de Túnez, Francia, el centro y el sur de Italia). La preparación de la biblioteca de ADN se realizó con Ion AmpliSeq™ Library Kit Plus (Thermo Fisher Scientific), a partir de 5 ng de ADN. La secuenciación de bibliotecas se realizó utilizando el instrumento Ion Torrent S5 (Thermo Fisher Scientific). Después de la secuenciación, las lecturas se asignaron al genoma JPCM5 de L. infantum (versión de lanzamiento TriTrypDB-45_LinfantumJPCM5_Genome) utilizando el navegador Torrent. Las variantes se llamaron usando LoFreq en Galaxy (Galaxy Versión 2.1.5 + galaxy0) [20] usando la configuración predeterminada. Se utilizaron Integrative Genomics Viewer o Ugene para la visualización de variantes. Posteriormente, se realizó un análisis filogenético molecular por el método de máxima verosimilitud basado en el modelo General Time Reversible [21] utilizando el software MEGAX.

El contenido de información de polimorfismo (PIC) para polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) se calculó como para los marcadores dominantes utilizando la ecuación simplificada descrita en Serrote et al. [22].

Los productos de PCR que abarcan polimorfismos informativos en los genes ME y GPI (es decir, 390T/G y 1831A/G, como en las secuencias de referencia DQ449701.1 y AJ620617.1, respectivamente) se obtuvieron utilizando un enfoque anidado con cuatro pares de cebadores (Tabla 2). Los dos pares de cebadores externos (incluido un par de cebadores publicado previamente [10]) se usaron para realizar el paso de preamplificación con PCR convencional (cPCR), mientras que los dos pares de cebadores internos se usaron para el segundo paso de amplificación con qPCR, seguido de Análisis de gestión de recursos humanos. Los cebadores se diseñaron con Primer-BLAST [23, 24] utilizando la enzima málica MHOM/FR/78/LEM75 de L. infantum y las secuencias GPI MHOM/TN/80/IPT1 como referencia. Las posiciones de los cebadores en los genes diana y los nucleótidos polimórficos se muestran en el archivo adicional 2: Figura S1 y en el archivo adicional 3: Figura S2.

Para garantizar la amplificación de muestras clínicas con baja carga parasitaria, incluimos un paso de preamplificación en la cPCR con cebadores externos. La cPCR se realizó por duplicado en un volumen de reacción final de 25 μl que contenía 2 μl de ADN molde, dNTP 200 μM, MgCl2 2,5 mM, 200 nM de cada cebador y 1 U de ADN polimerasa Hot-Rescue (Diatheva srl, Fano, Italia). ). La amplificación se realizó en un termociclador GeneAmp® PCR System 2700 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific), con un perfil de ciclado térmico de 94 °C durante 7 min, seguido de 15 ciclos a 94 °C durante 30 s, 60 °C durante 20 s y 72 °C durante 15 s. Se incluyó un tubo sin plantilla como control negativo.

Los ensayos qPCR-ME65 y qPCR-GPI88 dieron como resultado productos amplificados de 65 y 88 pb, respectivamente, que abarcan los polimorfismos 390T/G (qPCR-ME65) y 1831A/G (qPCR-GPI88), respectivamente. Todas las qPCR se llevaron a cabo en un volumen de reacción de 25 µl que contenía 1 µl de ADN molde (ADN genómico purificado para muestras de control y producto de PCR preamplificado para muestras clínicas) y 12,5 µl de TB Green PreMix ex Taq II Master Mix (Takara Bio Europa, Saint-Germain-en-Laye, Francia), con 200 nM de cada cebador. Las reacciones de qPCR se realizaron en un instrumento Rotor-Gene 6000 (Corbett Life Science, Mortlake, Australia), con un perfil de ciclo térmico de 94 °C durante 10 min, seguido de 45 ciclos a 94 °C durante 20 s, 60 °C. durante 20 s y 72 °C durante 20 s. Cada muestra se procesó por duplicado y no se procesó ningún control de plantilla en cada ejecución. Después de la amplificación, el análisis HRM se realizó en el rango de 77 a 88 °C, con aumentos de 0,1 °C/s y esperando 2 s en cada temperatura. Las curvas de HRM sin procesar se normalizaron mediante el software Rotor-gene 6000 v.1.7 (Corbett Life Science). En el ensayo qPCR-ME65, se utilizaron las cepas MHOM/FR/78/LEM75 y MHOM/TN/80/IPT1 como referencia para los genotipos 390T y 390G, respectivamente; en el ensayo qPCR-GPI88, se utilizaron las cepas MHOM/FR/78/LEM75, MHOM/TN/80/IPT1 y MHOM/IT/93/ISS822 como referencia para los genotipos 1831G, 1831A y 1831R (heterocigoto), respectivamente. La asignación de los genotipos 390T/G y 1831A/G se realizó mediante el software del instrumento con una confianza ≥ 85%.

Para evaluar la especificidad de los nuevos pares de cebadores (MEint-F/ME65-R, GPIext-F/GPIext-R y GPI88-F/GPI88-R), realizamos qPCR como se describe anteriormente usando 1 × 10–2 ng de L Infantum (cepas MHOM/FR/78/LEM75 y MHOM/TN/80/IPT1) y 30 ng de ADN humano, canino, felino y de Trypanosoma cruzi como plantilla. Los fragmentos amplificados se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,8% con tinción de ADN Midori Green Advance (NIPPON Genetics EUROPE GmbH, Düren, Alemania). Los geles se visualizaron bajo luz ultravioleta utilizando un aparato de gel doc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.). La escalera de ADN GeneRuler 100 pb Plus (Thermo Fisher Scientific) se incluyó como estándar de tamaño.

Para estimar la sensibilidad y aplicabilidad de las qPCR ME65 y GPI88 en muestras clínicas, establecimos curvas estándar utilizando diluciones en serie de ADN MHOM/FR/78/LEM75, que van desde 1 × 100 a 1 × 10-5 ng por tubo de reacción. Para evaluar la posible interferencia del ADN del huésped como fondo en el ensayo de qPCR, a cada tubo de reacción de qPCR se le agregaron 30 ng de ADN humano y canino purificado a partir de líneas celulares humanas y caninas (MCF7 y DH82, respectivamente). Las curvas estándar se obtuvieron de dos experimentos independientes realizados por duplicado.

Para confirmar el genotipo asignado por el software Rotorgene, los productos de amplificación obtenidos con cebadores externos se purificaron utilizando el kit de purificación por PCR MinElute (Qiagen, Hilden, Alemania) y se secuenciaron directamente. En total, se secuenciaron 23 y 44 productos de PCR para los genes ME y GPI, respectivamente. La secuenciación de ADN se realizó utilizando el kit de secuenciación de ciclo BigDye Terminator v.11 en un analizador genético ABI PRISM 310 (ambos Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). Los electroferogramas se analizaron utilizando el editor de alineación de secuencias BioEdit [25]. El genotipo heterocigoto se atribuyó cuando se observaron dos picos diferentes superpuestos en la misma posición.

Para evaluar las diferentes temperaturas de HRM entre los genotipos, realizamos una prueba de Kruskal-Wallis, seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn. Todas las pruebas estadísticas se realizaron con GraphPad Prism versión 8.0.2 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EE. UU.). Se consideró que un valor de p ≤ 0,05 indicaba significación estadística. Los resultados se muestran como el promedio de réplicas técnicas para cada muestra de al menos dos experimentos independientes ± desviación estándar (DE).

Los resultados del MLST (Sequence Read Archive [SRA] número de acceso: PRJNA911512) mostraron secuencias casi idénticas (1 a 3 discrepancias en comparación con el genoma de referencia de 15,488 bases) en todas las muestras, independientemente del origen geográfico o del huésped, con a excepción del aislado humano del centro de Italia, MHOM/IT/2019/cur-1, que mostró 25 discrepancias (Tabla 3). Específicamente, el análisis filogenético mostró que el aislado MHOM/IT/2019/cur-1 se agrupaba independientemente de las otras muestras de L. infantum (Fig. 1). El análisis de los resultados de MLST, junto con las secuencias disponibles en Genbank (ver Tablas 3 y 6 en [10]), permitió confirmar el polimorfismo 390T/G en el gen ME (correspondiente al nucleótido 281164 en el cromosoma 24 del L. infantum de referencia). genoma JPCM5 GCA_900500625.2) y del polimorfismo 1831A/G en el gen GPI (correspondiente al nucleótido 292809 en el cromosoma 12 del genoma JPCM5 de referencia GCA_900500625.2 de L. infantum), como los más informativos entre todos los polimorfismos encontrados (PIC = 0,47 y 0,35, respectivamente). Sobre la base de estos resultados, se desarrollaron dos ensayos basados ​​en HRM (es decir, qPCR-ME65 y qPCR-GPI88) para detectar rápidamente esos polimorfismos en muestras clínicas. El primero es una actualización de un ensayo publicado anteriormente [10] y el segundo es un ensayo completamente nuevo.

Análisis filogenético molecular por el método de máxima verosimilitud. La historia evolutiva se infirió utilizando el método de máxima verosimilitud y el modelo general reversible en el tiempo. Se muestra el árbol con la probabilidad logarítmica más alta (- 21365,37). El porcentaje de árboles en los que los taxones asociados se agruparon se muestra junto a las ramas. Los árboles iniciales para la búsqueda heurística se obtuvieron automáticamente aplicando algoritmos de unión de vecinos y BioNJ a una matriz de distancias por pares estimadas utilizando el enfoque de máxima verosimilitud compuesta (MCL), y luego seleccionando la topología con un valor de probabilidad logarítmica superior.

Los nuevos pares de cebadores (MEint-F/ME65-R, GPIext-F/GPIext-R y GPI88-F/GPI88-R) se probaron mediante qPCR para evaluar su especificidad utilizando ADN de L. infantum, T. cruzi, humano. , muestras caninas y felinas. Los fragmentos amplificados se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa como se describe en la sección Métodos. Los productos obtenidos fueron del tamaño esperado y no se detectó amplificación no específica (archivo adicional 4: Figura S3).

Las curvas de sensibilidad para qPCR ME65 y qPCR GPI88 evidenciaron un límite de cuantificación de 1 × 10−4 ng de ADN por tubo de PCR con R2 > 0,99 (Fig. 2). En presencia de ADN humano y canino como fondo, el ciclo de cuantificación (Cq) se retrasó ligeramente, pero la linealidad y el límite de cuantificación del ensayo permanecieron sin cambios.

Curvas de sensibilidad del ensayo qPCR-ME65 (a) y del ensayo qPCR-GPI88 (b). Las curvas estándar se enriquecieron con 30 ng de ADN humano o canino (curvas superiores parcialmente superpuestas, puntos de círculos y triángulos, respectivamente) o no se enriquecieron (curva inferior, puntos cuadrados). Cada punto representa el resultado duplicado de dos experimentos independientes. Cq, ciclo de cuantificación; GPI, glucosa-6-fosfato isomerasa; ME, enzima málica; qPCR, PCR cuantitativa en tiempo real

Para evaluar la capacidad de los ensayos HRM para discriminar los genotipos, los dos ensayos qPCR (qPCR-ME65 y qPCR-GPI88) se probaron primero en ocho cepas de L. infantum (muestras números 13 a 20, Tabla 1) con propiedades conocidas. secuencias. Se seleccionaron las cepas de Leishmania infantum MHOM/FR/78/LEM75, MHOM/TN/80/IPT1 y MHOM/IT/93/ISS822 como referencia para los genotipos 390T/1831G, 390G/1831A y 390T/1831R, respectivamente. Los análisis qPCR y HRM se realizaron como se describe en la sección Métodos, y los resultados mostraron que los diferentes genotipos se podían diferenciar mediante el análisis de la curva HRM (gráfico de derivada negativa) o los perfiles normalizados de HRM (Fig. 3). En particular, la cepa heterocigota GPI (1831R) se distinguió claramente tanto con los gráficos de derivada negativa (que muestran un pico doble típico; Fig. 3c) como con los perfiles HRM normalizados que mostraron una forma característica (Fig. 3d). Se obtuvieron resultados comparables con las cepas MHOM/DZ/82/LIPA59 (390G/1831A), MHOM/ES/81/BCN1 (390G/1831G), MHOM/IT/86/ISS218 (390T/1831G), MHOM/IT/ 08/31U (390T/1831G) y MHOM/IT/08/49U (390T/1831G) (no se muestran los resultados).

Análisis HRM de cepas de referencia de Leishmania infantum. a, b Los gráficos de derivados negativos de qPCR-ME65 HRM (a) y los perfiles normalizados (b) se obtuvieron utilizando ADN de MHOM/TN/80/IPT1 (genotipo 390G) y MHOM/FR/78/LEM75 (genotipo 390T). c, d Los gráficos de derivados negativos de qPCR-GPI88 HRM (c) y los perfiles normalizados (d) se obtuvieron utilizando ADN de MHOM/TN/80/IPT1 (genotipo 1831A), MHOM/FR/78/LEM75 (genotipo 1831G) y MHOM. /IT/93/ISS822 (genotipo 1831R). dF/dT, derivada de la intensidad de fluorescencia a diferentes temperaturas; GPI, glucosa-6-fosfato isomerasa; HRM, fusión de alta resolución; ME, enzima málica; qPCR, PCR cuantitativa en tiempo real; T, temperatura

Una vez demostrado el potencial de los dos ensayos qPCR para discriminar los genotipos 390T/G y 1831A/G en cepas de referencia, estos dos ensayos se probaron en nueve aislados clínicos y 64 muestras clínicas humanas y caninas del centro y sur de Italia y la isla de Pantelleria. , con el objetivo de evaluar la variabilidad genética de L. infantum en estas áreas mediante el método basado en HRM. En primer lugar, la presencia de L. infantum en muestras clínicas se confirmó mediante ITS1-PCR RFLP [18] y/o mediante qPCR dirigidas a minicírculos de ADN del cinetoplasto (kDNA) [16]. Para aumentar la sensibilidad y robustez de los ensayos 390T/G y 1831A/G HRM en muestras clínicas, en las que el ADN del parásito estaba mal representado, se introdujeron 15 ciclos del paso de preamplificación utilizando el par de cebadores externos, como se describe en la Sección de métodos. Posteriormente, se utilizó 1 µl de la reacción como plantilla para los ensayos de qPCR. Los genotipos de 61 y 53 muestras se distinguieron mediante los ensayos qPCR-ME65 y qPCR-GPI88, respectivamente, en las 64 muestras clínicas disponibles, mostrando una sensibilidad del 95,3% y 82,8%. En particular, la sensibilidad alcanzó el 100 % en los aislados clínicos (9 de 9 con ambos ensayos). En la Fig. 4 se muestra un ejemplo de gráficos de derivadas negativas y perfiles de HRM normalizados obtenidos con las muestras clínicas. Curiosamente, las muestras humanas 2073U y 2604U mostraron un perfil de HRM normalizado y un doble pico de HRM atribuible al genotipo heterocigoto tanto para ME como para GPI. genes (390K/1831R) (Fig. 4). Debido a la ausencia de una cepa de referencia heterocigota para el gen ME, estos amplicones se secuenciaron como se describe anteriormente. Los electroferogramas mostraron un pico doble en la posición 390 compatible con heterocigosidad (390K) (archivo adicional 5: Figura S4).

Análisis HRM de muestras clínicas de Leishmania infantum. a, b Gráficos de derivados negativos de qPCR-ME65 HRM (a) y perfiles normalizados (b) de muestras clínicas seleccionadas. Como referencia, se incluyeron en el ensayo las cepas MHOM/TN/80/IPT1 (genotipo 390G) y MHOM/FR/78/LEM75 (genotipo 390 T). c, d Gráficos de derivados negativos de qPCR-GPI88 HRM (c) y perfiles normalizados (d) de muestras clínicas seleccionadas. Como referencias, se incluyeron en el ensayo las cepas MHOM/TN/80/IPT1 (genotipo 1831A), MHOM/FR/78/LEM75 (genotipo 1831G) y MHOM/IT/93/ISS822 (genotipo 1831R). dF/dT, derivada de la intensidad de fluorescencia a diferentes temperaturas; HRM, fusión de alta resolución; GPI, glucosa-6-fosfato isomerasa; ME, enzima málica; qPCR, PCR cuantitativa en tiempo real

El poder de discriminación de genotipo de los ensayos qPCR-ME65 y qPCR-GPI88 también se evaluó mediante el análisis de las temperaturas HRM de todas las muestras de L. infantum. El ensayo qPCR-ME65 proporcionó evidencia de una diferencia estadísticamente significativa entre la temperatura de fusión (Tm) media (± DE) del genotipo 390G (83,56 °C ± 0,09 °C) y la de los genotipos 390T o 390K (82,91 °C ± 0,11 °C). C y 82,97 °C ± 0,04 °C, respectivamente) (Kruskal-Wallis seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn, P <0,001) (Fig. 5a), lo que confirma la aplicabilidad del método para muestras clínicas. De la misma manera, la Tm media (± DE) en el ensayo qPCR-GPI88 permitió distinguir las muestras con genotipo 1831G (81,85 °C ± 0,12 °C) de aquellas con genotipo 1831A o 1831R (81,30 °C ± 0,11 °C). C y 81,41 °C ± 0,14 °C, respectivamente) (Kruskal-Wallis seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn, P <0,001) (Fig. 5b). Sin embargo, la Tm de las muestras con amplicones heterocigotos (es decir, 390K y 1831R) mostró una superposición parcial con la Tm de las muestras con genotipo 390T o 1831A, respectivamente; por lo tanto, los dos genotipos no se podían distinguir exclusivamente según la Tm. Sin embargo, este inconveniente puede superarse con la presencia del segundo pico de HRM. Aunque el análisis de este segundo pico requirió que se redujera el umbral de fluorescencia, el pico se distinguió del fondo y mostró una Tm media (± DE) de 80,39 °C ± 0,08 °C y 79,40 °C ± 0,14 °C para el 390K. y amplicones 1831R, respectivamente (Fig. 4a, c). Esta característica de las muestras heterocigotas fue confirmada por los perfiles normalizados de HRM (Fig. 4b, d).

Temperaturas HRM de muestras de Leishmania infantum. a Temperaturas HRM de amplicones obtenidas mediante qPCR-ME65, b Temperaturas HRM de amplicones obtenidas mediante qPCR-GPI88. Las temperaturas representan la media ± DE de las réplicas técnicas de al menos dos experimentos independientes. Los asteriscos indican una diferencia significativa en ***p <0,001, Kruskal-Wallis seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn. HRM, fusión de alta resolución; GPI, glucosa-6-fosfato isomerasa; ME, enzima málica; qPCR, PCR cuantitativa en tiempo real

Para confirmar el genotipo asignado por el software Rotorgene según el análisis HRM, primero purificamos los productos de amplificación de las cepas de referencia y muchas muestras clínicas y luego las secuenciamos como se describe en Métodos. Otras secuencias fueron obtenidas por el panel MLST (número de acceso SRA: PRJNA911512) o de nuestra publicación anterior [10]. La presencia de dos picos superpuestos diferentes en la misma posición de nucleótido se asoció con un genotipo heterocigoto. En resumen, estaban disponibles 43 y 53 secuencias que abarcaban los polimorfismos en los genes ME y GPI. Los resultados mostraron una correlación del 100% con la determinación del genotipo basada en los ensayos HRM. Archivo adicional 5: Figura S4 y archivo adicional 6: Figura S5 muestran electroferogramas de amplicones clínicos seleccionados obtenidos con qPCR-MEint y qPCR-GPIext, respectivamente.

Según los resultados del análisis simultáneo de los dos polimorfismos, pudimos asignar siete genotipos diferentes (G1-G7) en 82 de 93 muestras. Entre estos siete genotipos, el genotipo 1 (G1) fue el más representado (38 de 82 muestras; prevalencia del 46,3%) (Tabla 4). Los resultados del genotipado para cada cepa, muestra clínica y aislado clínico de L. infantum se resumen en la Tabla 5. Es de destacar que el genotipo G1 caracterizó 12 de 14 (85,7%) cepas/aislados de L. infantum pertenecientes a MON-1 y MON. -72 zimodemas. Por el contrario, el genotipo G1 no se encontró en ninguno de los zimodemas distintos de MON-1/MON-72 (Tabla 5). Excluyendo las muestras de la isla Pantelleria, se confirmó que G1 es el genotipo más frecuente tanto en la población humana (prevalencia del 42,9%) como en la canina (prevalencia del 84,6%); En particular, las muestras humanas mostraron más variabilidad genética en comparación con las de perros (Fig. 6). Sin embargo, en el contexto insular de la isla de Pantelleria, la situación de las muestras caninas es completamente inversa: 12 de 17 muestras presentaron el genotipo 6 (G6) (390T/1831A; prevalencia del 70,6%) y el genotipo G1 tuvo una prevalencia de sólo el 23,5 % (Figura 6). La muestra canina Els-mai, procedente de la clínica veterinaria "Santa Teresa" de Fano (centro de Italia) fue un caso inusual en el que los dos hisopos conjuntivales pertenecían a dos genotipos diferentes (Els-maia: G6; Els-maib: G1). Además, dos muestras humanas (es decir, 2073U, 2604U) mostraron heterocigosidad en los polimorfismos ME y GPI (G7).

Distribución de genotipos en muestras humanas y caninas. Las muestras humanas (n = 49) incluyen los siete genotipos con una marcada prevalencia del genotipo G1 (42,9%), seguido de los genotipos G3 (22,4%) y G5 (14,3%). Las muestras caninas del centro y sur de Italia (n = 13) mostraron una marcada prevalencia del genotipo G1 (84,6%), mientras que las muestras caninas de la isla Pantelleria (n = 17) mostraron una prevalencia del genotipo G6 (70,6%).

La taxonomía del género Leishmania es muy compleja y ha sido revisada varias veces a lo largo de los años de acuerdo con las características bioquímicas y biológicas de los parásitos [26]. En el presente estudio, nos centramos en las especies de L. infantum, el principal agente causante de CanL y VL y CL humanas. La tipificación de Leishmania a nivel de especie y cepa es importante para estudios epidemiológicos [27], para la identificación de nuevos reservorios y para predecir el curso clínico de la infección, particularmente en humanos (cepas dermotrópicas y viscerotrópicas) [28]. La técnica de referencia para tipificar miembros del género Leishmania es el método MLEE [1], que se basa en la movilidad electroforética de diversas enzimas obtenidas de los promastigotes. Con base en esta técnica, las especies de Leishmania se clasifican en zimodemas (también denominados MON). En Italia, MON-1 y MON-72 son los zimodemas de L. infantum más representados en perros infectados, mientras que las infecciones en humanos son causadas por una población de zimodemas más heterogénea [27], lo que sugiere que los perros no son los únicos reservorios de infección y enfatiza La importancia de los estudios epidemiológicos. Un trabajo reciente de Castelli et al. [29] realizado en Sicilia (Italia) sobre aislados de Leishmania de humanos y perros reveló que 71 de 78 muestras (91%) eran MON-1, lo que se confirmó como el zimodema predominante en el área mediterránea; las siete muestras restantes (9%) no eran MON-1. En particular, las cepas distintas de MON-1 se aislaron de humanos. Además, cada vez son más los estudios que investigan el papel de otros mamíferos como reservorios de Leishmania, como las liebres [30], los conejos [31], los lobos [32] y, en particular, los gatos domésticos [33]. En este contexto, un enfoque que permita una caracterización rápida de los parásitos podría ser útil para estudios epidemiológicos. Sin embargo, la técnica MLEE está asociada con una serie de limitaciones, incluida la necesidad de cultivar parásitos. Como alternativa a MLEE, además de los métodos MLST y MLMT, se han intentado otros enfoques para caracterizar la diversidad genética en poblaciones de L. infantum. En particular, estudios recientes han explotado el SNP en minicírculos de ADNk para identificar diferentes genotipos de L. infantum en el área del Mediterráneo [34, 35]. Este enfoque se basó en la amplificación por PCR de una región minicírculo seguida de análisis RFLP o secuenciación de ADN y luego RFLP in silico.

El objetivo del presente estudio fue encontrar un método de detección alternativo, rápido y económico para explorar la variabilidad genética de L. infantum que circula en la región mediterránea. Por lo tanto, nos centramos en el seguimiento basado en HRM de los SNP que se encuentran en las enzimas metabólicas utilizadas en el enfoque MLEE. Para identificar polimorfismos útiles para la tipificación rápida de L. infantum, primero diseñamos un panel MLST personalizado y luego secuenciamos nueve cepas y aislados clínicos de L. infantum. Con base en los resultados del panel MLST, se identificó y seleccionó un polimorfismo informativo en los genes GPI (1831A/G) para desarrollar un ensayo basado en qPCR-HRM para la detección de muestras clínicas, que se utilizará en asociación con un método de genotipado actualizado inicialmente desarrollado y aplicado por Ceccarelli et al. [10] en el gen ME. Sorprendentemente, debido al paso de preamplificación, fue posible aplicar este método a muestras clínicas sin aislamiento del parásito. Este aspecto representa una ventaja importante en comparación con otros enfoques biomoleculares para la tipificación de Leishmania realizados en cepas y aislados clínicos [36, 37].

En particular, en nuestro trabajo anterior, demostramos que el polimorfismo 390T en el gen ME estaba asociado con los zimodemas MON-1, MON-72 y MON-201 [10]. En el presente estudio, con el uso simultáneo de los dos polimorfismos, pudimos distinguir la cepa MHOM/IT/93/ISS822 (MON-201) de MON-1 y MON-72 aprovechando la heterocigosidad encontrada en la posición 1831 del Gen GPI, como también lo confirma la secuenciación (archivo adicional 6: Figura S5). También se encontró heterocigosidad en los aislados clínicos V2921 y MHOM/IT/2019/cur-1 y en ocho muestras clínicas. La heterocigosidad no es sorprendente ya que se ha informado previamente en otras enzimas metabólicas del complejo Leishmania donovani [37], en asociación con el origen geográfico del parásito [38]. Sin embargo, la detección de heterocigosidad podría presentar algunas limitaciones al ensayo. De hecho, Leishmania spp. es un parásito con una aneuploidía constitutiva [39, 40] y es posible que nuestro enfoque HRM pueda identificar la heterocigosidad solo si está cerca del 50%. Sin embargo, este nuevo método de genotipado basado en HRM, que utiliza sólo dos objetivos moleculares, pudo distinguir siete genotipos diferentes (denominados G1-G7). No es posible una correlación unívoca entre los ensayos de genotipado basados ​​en MLEE y HRM ya que los dos enfoques son diferentes. Sin embargo, los resultados de este estudio mostraron que el genotipo G1 (el genotipo más prevalente) tiene una fuerte correlación (aunque no unívoca) con los zimodemas MON-1 y MON-72. De hecho, el 85,7% de las tinciones/aislados MON-1 y MON-72 que tenían secuencias ME y GPI disponibles se asignaron al genotipo G1. Las únicas excepciones fueron las cepas de referencia MHOM/TN/80/IPT1 y V2921, que, a pesar de ser MON-1, fueron asignadas a los genotipos G3 y G5, respectivamente. Es posible que el origen geográfico de la cepa MHOM/TN/80/IPT1 (una cepa tunecina) o del huésped (V2921 se aisló de una marta) condujera a estas diferencias. A pesar del aumento en el poder de discriminación en el método informado en el presente estudio en comparación con el informado en nuestra publicación anterior [10], no se encontraron diferencias genotípicas entre los zimodemas MON-1 y MON-72. Sin embargo, esto puede no representar un problema. De hecho, MON-1 y MON-72 son los zimodemas más representados en perros [29, 41]; por lo tanto, la identificación de genotipos diferentes al G1 podría ser útil para estudiar y comprender el papel exacto de los perros en la transmisión del patógeno e identificar otros reservorios de infección para los humanos. Con la exclusión de las muestras de la isla Pantelleria, el 42,9 % y el 84,6 % de las muestras/aislamientos clínicos humanos y caninos fueron asignados al genotipo G1. Según la correlación entre G1 y MON-1, se puede considerar que los resultados están de acuerdo con los datos publicados que muestran que MON-1 es el zimodema predominante en el área del Mediterráneo [5]. El hecho de que el porcentaje del genotipo G1 en muestras humanas fuera poco más de la mitad que en muestras caninas parece confirmar la mayor variabilidad genética de los parásitos en humanos respecto a los perros, lo cual es explicable al considerar el papel de otros mamíferos como reservorios de infección. como se ha mencionado más arriba. En particular, también se han descrito previamente diferentes distribuciones de genotipos entre humanos y perros en un área geográfica pequeña utilizando diferentes marcadores genéticos [34], lo que refuerza la posibilidad de que L. infantum que circula en humanos pueda depender de múltiples reservorios. Sin embargo, dado que las comparaciones de genotipos de L. infantum entre diferentes estudios aún son complicadas por la cantidad de métodos y secuencias utilizadas, sería necesaria la unificación y estandarización de los marcadores moleculares para una mejor comprensión de la epidemiología del parásito.

Respecto a las muestras procedentes de la isla Pantelleria, cabe destacar que esta isla se caracteriza por tener unas condiciones ideales para estudiar la leishmaniasis en una población animal definida y en un territorio circunscrito y central de la cuenca mediterránea. Estudios anteriores informaron una prevalencia de leishmaniasis del 27% en la población canina de la isla, lo que está en línea con la prevalencia promedio en la región de Sicilia, lo que indica una circulación activa del parásito en la isla [12, 42]. En esta área, sólo el 23,5% de los aislados/muestras clínicas caninas se asociaron con el genotipo G1, mientras que el 70,6% se identificaron como el genotipo G6 (390T/1831A). El enriquecimiento del genotipo G6 en muestras de la isla Pantelleria, en comparación con los genotipos de otras muestras de la península italiana, podría explicarse por el aislamiento natural de la isla Pantelleria que resultó en una mezcla limitada de los grupos genéticos.

Además de todas las consideraciones mencionadas anteriormente, de algunas muestras clínicas han surgido resultados interesantes. Por ejemplo, Bra-aii (G3) se agrupa con MHOM/TN/80/IPT1 en el panel MLST, lo que sugiere la posibilidad de que sea un MON-1, lo que confirma la heterogeneidad genotípica dentro del zimodema MON-1, como se describe en otros trabajos. 43]. Además, obtuvimos dos genotipos diferentes de hisopos conjuntivales izquierdo y derecho de la muestra clínica canina Els-mai (G1 y G6, respectivamente), resultado que podría explicarse por una posible coinfección con dos cepas diferentes del patógeno. También se obtuvieron datos interesantes de dos muestras clínicas humanas (es decir, 2073U, 2604U) que pertenecen al G7; estas fueron las únicas muestras que eran heterocigotas para el gen ME.

En general, los resultados obtenidos, confirmados mediante la secuenciación de productos de PCR, han demostrado que nuestro enfoque HRM es sólido y aplicable para el genotipado de muestras clínicas, así como para estudios epidemiológicos. Aunque utilizar sólo dos SNP podría ser una limitación para fines de genotipado debido al bajo poder discriminatorio, este enfoque permitió la identificación rápida de siete genotipos diferentes, con la gran ventaja de poder trabajar en muestras clínicas con reactivos asequibles y sin necesidad de parásitos. aislamiento.

Un total de nueve aislados/cepas de L. infantum han sido secuenciados mediante un panel MLST que cubre 14 enzimas metabólicas. El análisis de estas secuencias y de secuencias disponibles en la base de datos Genbank permitió identificar dos polimorfismos informativos explotables para diferenciar genotipos de L. infantum en muestras de la cuenca mediterránea (390T/G y 1831A/G, en los genes ME y GPI, respectivamente). ). Se desarrollaron dos ensayos basados ​​en HRM para diferenciar estos genotipos. La aplicación de esta técnica en nueve aislados clínicos y 64 muestras clínicas sin aislamiento del parásito permitió identificar siete genotipos diferentes. Además, encontramos una correlación entre el genotipo G1 (390T/1831G) y los zimodemas MON-1 y MON-72, lo que permite una rápida identificación de los zimodemas de L. infantum más comunes. Esto se confirma en nuestro estudio, donde G1 representó el 42,9% y el 84,6% de las muestras/aislados clínicos humanos y caninos, respectivamente. Curiosamente, este porcentaje cambió en la isla de Pantelleria, donde la prevalencia de G1 fue sólo del 23,5% mientras que la de G6 fue del 70,6%.

En conclusión, este enfoque podría encontrar aplicación como herramienta de detección rápida y económica para la caracterización de aislamientos clínicos de L. infantum en estudios epidemiológicos, para identificar nuevos reservorios de infección y para investigar la variabilidad genética de L. infantum.

Los datos MLST presentados en el estudio se depositan en el archivo de lectura de secuencias (SRA) del repositorio del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), y el número de acceso (número de acceso SRA) es PRJNA911512.

Leishmaniasis canina

Leishmaniasis cutánea

PCR convencional

Ciclo de cuantificación

Glucosa-6-fosfato isomerasa

Fusión de alta resolución

ADN cinetoplasto

enzima málica

Electroforesis enzimática multilocus

Tipificación de microsatélites multilocus

Tipificación de secuencia multilocus

Secuenciación de próxima generación

Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción

PCR cuantitativa en tiempo real

Polimorfismos de un sólo nucleótido

Temperatura de fusión

leishmaniasis visceral

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Nos gustaría agradecer a la Dra. Sabina Fattori y al Dr. Emanuele Gasparini de la Clínica Veterinaria Santa Teresa, Fano (PU) (Italia), por proporcionar muestras clínicas caninas, y al Dr. Giovanni Corbelli de la Unidad de Enfermedades Infecciosas del Hospital Marche Nord. , Pesaro (Italia), por facilitarnos muestras clínicas humanas.

Este trabajo fue financiado parcialmente por fondos del Ministerio de Salud italiano (número de subvención Ricerca Corrente 2021 IZS SI 04/21) y FANOATENEO. El financiador no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y análisis de datos, la interpretación de los datos o la redacción del manuscrito.

Departamento de Ciencias Biomoleculares, Universidad de Urbino Carlo Bo, Urbino, PU, ​​Italia

Gloria Buffi, Marcello Ceccarelli, Aurora Diotallevi, Michelalberto Abruzzese, Francesca Andreoni, Daniela Bencardino, Mauro Magnani y Luca Galluzzi

Laboratorio de Referencia de la OIE sobre Leishmania, Centro Nacional de Referencia para la Leishmaniasis (C.Re.Na.L.), Instituto Zooprofiláctico Experimental de Sicilia, Palermo, PA, Italia

Federica Bruno, Germano Castelli y Fabrizio Vitale

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Concepción y diseño del estudio: MC, GB, FV, GC, FB y LG. Adquisición de datos: GB, MC, MA, FA, DB y AD. Análisis e interpretación de datos: GB, MC, LG, AD y MM. Redacción del artículo: GB, MC, MA. Revisando críticamente el artículo por contenido intelectual importante: LG, FV, GC, FB y MM. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Luca Galluzzi.

El uso de hisopo conjuntival canino fue aprobado por el Comité Ético para la Experimentación con Animales de la Universidad de Urbino (CESA) el 31 de julio de 2012. El título del estudio fue “Diagnóstico biomolecular de la leishmaniasis mediante el uso de muestras clínicas no invasivas y su uso para seguimiento terapéutico” (Prot. CESA 2/2012).

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

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Tabla S1. Genes y coordenadas genómicas del panel MLST diseñado con el diseñador Ion AmpliSeq™ utilizando el ensamblaje del genoma JPCM5 de L. infantum GCA_900180445 como referencia.

Figura S1. Secuencia del gen ME de L. infantum MHOM/FR/78/LEM75 (DQ449701.1) y cebadores utilizados para PCR-MEint y PCR-ME65. Los cebadores PCR-MEint están en negrita y el cebador ME65-R está subrayado. MEint-F es común para ambos ensayos de qPCR. La posición polimórfica (390T/G) está encajonada.

Figura S2. Secuencia del gen GPI de L. infantum MHOM/FR/78/LEM75 (AJ620617.1) y cebadores utilizados para PCR-GPIext y PCR-GPI88. Los cebadores PCR-GPIext están subrayados y los cebadores PCR-GPI88, en negrita. La posición polimórfica (1831A/G) está encuadrada.

Figura S3. Evaluación de especificidad de los cebadores GPIext-F/GPIext-R (a), MEint-F/ME65-R (b) y GPI88-F/GPI88-R (c). M, marcador de escalera de ADN de 100 pb; LEM75, MHOM/FR/78/LEM75; IPT1, MHOM/TN/80/IPT1; H, ADN humano; D, ADN de perro; C, ADN de gato; T, ADN de Trypanosoma cruzi; NTC, sin control de plantilla.

Figura S4. Electroferogramas de las muestras clínicas 2073U y 2604U obtenidos con qPCR-MEint en comparación con cepas de referencia. Las flechas evidencian el SNP diagnóstico en la posición 390.

Figura S5. Electroferogramas de amplicones seleccionados obtenidos con qPCR-GPIext. Las flechas indican la posición 1831 donde se encontró un SNP de diagnóstico. En particular, es evidente la heterocigosis de la cepa MHOM/IT/93/ISS822 y el aislado clínico V2921. Además, los electroferogramas demuestran resultados diferentes en hisopos conjuntivales izquierdo y derecho de la muestra clínica canina Els-mai. Els-maia, hisopo conjuntival izquierdo; Els-maib, hisopo de conjuntival derecho.

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Reimpresiones y permisos

Buffi, G., Ceccarelli, M., Diotallevi, A. et al. Detección basada en fusión de alta resolución (HRM) de polimorfismos en la enzima málica y los genes de la glucosa-6-fosfato isomerasa para el genotipado de Leishmania infantum. Vectores de parásitos 16, 282 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05878-y

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Recibido: 24 de febrero de 2023

Aceptado: 11 de julio de 2023

Publicado: 14 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05878-y

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