Ondas sonoras para solucionar el problema de la recristalización en criopreservación

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 7603 (2023) Citar este artículo

1084 Accesos

4 altmétrico

Detalles de métricas

Los biobancos de órganos son la asignatura pendiente de la criopreservación. Aunque el problema es multifacético, los avances de las últimas décadas lo han relacionado en gran medida con lograr un recalentamiento rápido y uniforme de las muestras criopreservadas. Este es un desafío físico ampliamente investigado en el pasado, además de los estudios de toxicidad de los crioprotectores, que también han mostrado un gran avance. Este artículo presenta una prueba de principio, basada en el nematodo Caenorhabditis elegans, de una tecnología capaz de realizar tal función: ultrasonido enfocado de alta intensidad. Así, evitando el problema de la recristalización, este gusano, en su estado adulto, conservado a − \(80\;^\circ{\rm C}\), ha sido resucitado sistemáticamente tras ser calentado con Ultrasonido Focalizado de Alta Intensidad. (HIFU) ondas. La gran ventaja de esta tecnología es que es escalable; Además, el recalentamiento puede controlarse en tiempo real mediante termografía por resonancia magnética y controlarse mediante interferometría acústica. Anticipamos que nuestros hallazgos son el punto de partida para un posible enfoque de recalentamiento que pueda usarse para la criopreservación de sistemas a escala milimétrica: ya sea sola o en combinación con otras formas prometedoras de calentamiento, como el nanocalentamiento o el calentamiento dieléctrico, la tecnología actual proporciona nuevas formas. de resolver los aspectos físicos del problema de la recristalización en criopreservación, abriendo la puerta al almacenamiento a largo plazo de muestras más grandes.

La conservación de órganos en bancos a bajas temperaturas ofrece innumerables oportunidades1,2. Actualmente, esta posibilidad sigue siendo difícil de alcanzar, con sólo algunos éxitos parciales y aislados, es decir, en el riñón de conejo, el ovario de oveja o el hígado3,4,5. Aunque existen diferentes estrategias de criopreservación, para el almacenamiento criogénico de órganos a largo plazo, el daño causado por la eventual aparición de cristales de hielo es en gran medida responsable de esta situación. En los siguientes párrafos intentaremos enmarcar el problema dentro del contexto general de la criopreservación. A continuación entenderemos por qué un recalentamiento rápido y uniforme consigue evitarlo. Finalmente veremos cómo el ultrasonido focalizado de alta intensidad es capaz de ofrecer la solución.

Ya en 1940 Luyet6 comprendió bien que la vidriación de los sistemas biológicos era posible simplemente cruzando la zona donde el hielo podía aparecer a una velocidad suficiente. Esto se representa simbólicamente en la Fig. 1: cuando la temperatura sube o baja, pasamos de una fase a otra; sin embargo, podemos saltarnos una determinada fase si el cambio de temperatura es lo suficientemente rápido. Así, podemos pasar del líquido al vidrio, y viceversa, sin pasar por el estado cristalino; para ello basta con que el tiempo característico de esta transición sea menor que el tiempo característico requerido para la nucleación y crecimiento del hielo.

Efectos de las velocidades de enfriamiento y calentamiento sobre el cambio de fase de un sistema acuoso. El eje horizontal representa la temperatura en Kelvin, con las temperaturas de transición entre los cuatro estados (vidrio, cristal, líquido y gas) etiquetadas como Tglass (temperatura de transición vítrea), Tmelt (temperatura de fusión) y Tboil (temperatura de vaporización). Este eje se puede recorrer en ambos sentidos, correspondiendo a los cambios de estado al cruzar las temperaturas marcadas. El eje vertical representa la velocidad a la que se produce el cambio de temperatura. A modo ilustrativo se representa la disposición de las moléculas del sistema para los cuatro estados mencionados. En este diagrama resulta de especial interés la velocidad a la que atraviesa las temperaturas marcadas, siendo la más relevante para el tema que nos ocupa el cambio del estado líquido a vítreo. Un cambio de temperatura excesivamente lento (valores bajos en el eje vertical) para pasar de la fase líquida a la vítrea, y viceversa, implica el necesario paso por la fase cristalina, que en sistemas acuosos implica la formación de hielo. En cambio, las altas tasas de enfriamiento y/o calentamiento (valores altos en el eje vertical) pasan por alto la región "cristalina", dando un cambio directo entre los estados líquido y vítreo.

El problema con el que se topó Luyet fue que tales tasas de enfriamiento y calentamiento a menudo eran imposibles de alcanzar en sistemas de más de unas pocas decenas de micrones. Aunque era consciente de que esas tasas podían reducirse con la adición de solutos, decidió explorar un camino diferente: intentar conseguirlas mejorando la transferencia de calor. Por lo tanto, sólo pudo salvar una pequeña cantidad de pequeños sistemas biológicos a través del proceso.

No fue hasta el descubrimiento del glicerol7 que estas velocidades estuvieron dentro de lo técnicamente factible. Para ello es fundamental la deshidratación producida por el hielo extracelular8,9. Es la técnica conocida como congelación lenta que se utiliza actualmente en miles de laboratorios.

Posteriormente, la aparición de otros crioprotectores ha propiciado el desarrollo de alternativas a la congelación lenta. Estos no necesitan hielo extracelular para conseguir la vidriación del interior celular. Debido a esta ausencia total de hielo, tanto en el interior como en el exterior de las células, reciben el nombre genérico de técnicas de vitrificación. En este caso, es común distinguir entre vitrificación en equilibrio y no equilibrio, a saber. En la vitrificación en equilibrio (según Farrant10), se añaden al sistema concentraciones crecientes de crioprotector a medida que su temperatura desciende, imitando así, hasta cierto punto, el efecto del hielo extracelular en la congelación lenta. Dada su toxicidad11,12, la cantidad de crioprotector para cada temperatura se mantiene al mínimo, lo justo para evitar la formación de hielo, siguiendo el diagrama de equilibrio termodinámico sólido-líquido; de ahí su nombre10,13,14,15. En cambio, en la técnica conocida como vitrificación de no equilibrio, todo el crioprotector se añade desde el principio, o en un número reducido de pasos, pero siempre, generalmente, a temperaturas superiores a cero y en concentraciones capaces de alcanzar la vitrificación con simplemente inmersión. la muestra en nitrógeno líquido16,17. Evidentemente, existen estrategias intermedias. En ellos, la concentración de crioprotector no sigue la línea del diagrama de fases, sino que permanece dentro de la banda acotada entre la posibilidad de subenfriamiento y el límite de toxicidad3,18; o se juega con la compatibilidad de la vida con una apariencia moderada de hielo19,20. En resumen y centrándonos en lo que aquí nos ocupa: (1) las técnicas de criopreservación se diferencian entre sí fundamentalmente en la cantidad de crioprotector que tiene el sistema para cada temperatura; (2) dicha cantidad de crioprotector gobierna la posición, el ancho y las velocidades a las que se debe cruzar esta zona en la Fig. 1 en ambas direcciones para evitar la formación de hielo21; y (3) en cualquier caso, esta cantidad de crioprotector se mantiene al mínimo, dada su toxicidad. Con todo esto, hoy el problema se centra en la optimización de tres factores: la transferencia de masa, la transferencia de calor y la toxicidad de los crioprotectores. Y aquí es donde entra fundamentalmente en juego la geometría y las dimensiones del sistema, y ​​en consecuencia, el origen de la dificultad en la criopreservación de órganos: con sistemas pequeños se pueden conseguir velocidades de enfriamiento/calentamiento muy altas y así mantener la concentración. de crioprotector bajo22. Sin embargo, cuando los sistemas son grandes, es más difícil alcanzar este equilibrio entre toxicidad y transferencia de calor, por lo que frecuentemente el hielo aparece de forma letal, tanto en los vidriados por congelación lenta23 como por vitrificación4,24, aunque generalmente con parámetros muy diferentes. valores, pero el origen del problema es fundamentalmente el mismo en los dos casos.

Paradójicamente, es más fácil evitar la formación de cristales de hielo letales durante el enfriamiento que durante el calentamiento21. El origen de este curioso comportamiento reside en la existencia de una doble necesidad para la aparición de dichos cristales: la de su nucleación y la de su crecimiento. Debido a que el crecimiento requiere baja viscosidad, ocurre preferentemente a altas temperaturas. Sin embargo, la nucleación es más probable a temperaturas muy bajas, generalmente cercanas a Tg (típicamente \(\sim -100 \; ^\circ{\rm C}\) para soluciones y \(\sim -47 \; ^\circ{ \rm C}\) para celdas25). Así, cuando un sistema se enfría, primero cruza la “zona de crecimiento”, pero por ahora no hay “nada que crecer” (aún no hay núcleos). Sólo después se alcanza la zona de nucleación y pueden aparecer pequeños embriones de hielo que no crecerán, y por tanto no son letales en principio. Finalmente el sistema se vidria y se almacena. Sin embargo, cuando se recalienta, puede producirse una recristalización (o incluso una desvitrificación)26. El recalentamiento comienza cruzando, y por segunda vez, la zona de alta nucleación, con posible aparición de nuevos embriones; de hecho, Boutron27 señaló la presencia de \({10}^{6}\) a \({10}^{12}\) veces más núcleos al recalentarse desde el estado amorfo que al enfriarse desde el estado líquido. Finalmente se vuelve a cruzar la zona de crecimiento, donde ahora habrá un número considerable de núcleos oportunistas que pueden crecer hasta un tamaño letal. Estos cristales, que son más numerosos, como decimos, durante el recalentamiento, ven favorecido su crecimiento a medida que aumenta la temperatura28. La forma de evitar este crecimiento es atravesar esta zona muy rápidamente. Por eso una alta tasa de calentamiento es crucial y, en cierto sentido, más importante que la tasa de enfriamiento; Recientemente se ha destacado la relevancia del recalentamiento como un cambio de paradigma en la criopreservación24. El lector interesado puede encontrar en la bibliografía un análisis profundo y detallado de los temas desarrollados en este párrafo29.

En los sistemas criopreservados mediante congelación lenta, como es el caso de este estudio, a diferencia de la vitrificación, el problema de la recristalización y la consiguiente necesidad de altas tasas de calentamiento se ha identificado consistentemente en todo tipo de situaciones. Esto ha llevado a recomendar altas tasas de calentamiento dentro de los Buenos Procesos de Fabricación (BPM)30,31. Así, es bien conocido cómo de esta forma se evita la recristalización en muestras que van desde el tamaño de espermatozoides32 hasta bolsas de sangre30, incluyendo incluso crioviales en terapia celular33. Recientemente se ha estudiado un caso de interés en el contexto de CAR-T34, donde estudios conjuntos de criomicroscopía y calorimetría han identificado el beneficio de altas tasas de calentamiento para evitar la recristalización.

Para conseguir altas velocidades de recalentamiento se han propuesto diferentes formas de aplicación del campo electromagnético dada su capacidad de penetración y, por tanto, en principio escalable. Esta solicitud se ha realizado ya sea directamente35,36,37,38 o indirectamente a través de un agente mediador39,40,41. Recientemente se han producido importantes avances en esta materia42. Puede encontrar una tabla que compara los diferentes métodos de calentamiento volumétrico en Información complementaria.

Una alternativa al campo electromagnético, también penetrante43, son los Ultrasonidos Focalizados de Alta Intensidad (HIFU)44. El origen de aplicación del HIFU se remonta a 192745, donde ya se hablaba de que era un campo con un amplio abanico de posibilidades para investigar. 15 años después los primeros tumores estaban siendo quemados por el intenso calor generado por estas olas46. Sin embargo, no fue hasta el desarrollo de NMR47 que las técnicas de imagen permitieron el control HIFU basado en termografía por resonancia magnética. Hoy en día existe una amplia gama de configuraciones (secuencias) de resonancia magnética disponibles que permiten obtener imágenes térmicas 3D de muchos tejidos en diferentes circunstancias48. Por otro lado, cabe señalar que la atenuación y penetrabilidad del ultrasonido es función de su frecuencia (por ejemplo, a 1 MHz la onda de ultrasonido se atenúa aproximadamente un 50% al propagarse a través de 7 cm de tejido blando, y a 2 MHz la onda se reduce a aproximadamente un 25% de su valor inicial por el mismo tejido43). Por lo tanto, para muestras de gran tamaño, es aconsejable disponer de un conjunto de transductores, ya que esto mejora la penetración efectiva de la onda y su escalabilidad al controlar las fases relativas de la onda de cada canal, lidiando con los cambios en el biomaterial y las inhomogeneidades (fracturas, hielo, …) en tiempo real. En este trabajo utilizamos solo un transductor (muestras de tamaño mm); en simulaciones por computadora anteriores exploramos veintiséis transductores (tamaño en cm)44. Hoy en día son habituales los dispositivos formados por miles de transductores, que permiten calentar con una precisión superior a una décima de grado en multitud de terapias médicas49.

Nuestro grupo de investigación publicó recientemente44,50 el resultado de simulaciones por ordenador de HIFU para recalentamiento en criopreservación con la promesa de ponerlo en práctica en el presente trabajo. Para ello hemos utilizado C. elegans como prueba de principio. La criopreservación convencional de C. elegans23,51 se ve afectada por el problema de la recristalización, manteniendo bajas tasas de recuperación en los estadios larvarios más pequeños –L1 y L2– (35%), y prácticamente nulas en el estadio adulto51. Sin embargo, si el recalentamiento es rápido, esto no ocurre52. En las siguientes líneas mostramos, por primera vez, la presentación de HIFU para evitar el problema de la recristalización basado en este gusano. Para ello, se cultivaron nematodos N2 en condiciones habituales, en \(20\;\mathrm{^\circ{\rm C} }\). Con la población estabilizada después de al menos 5 generaciones, se llevó a cabo el proceso de criopreservación. Para el recalentamiento siempre se formaron dos grupos: un grupo control, recalentado de forma estándar23,51, y uno experimental, recalentado con ultrasonido. Los siguientes párrafos describen los desafíos técnicos que hubo que superar, los detalles de los experimentos realizados y, finalmente, los resultados obtenidos.

Como comentábamos, previo a la realización de los experimentos hubo que abordar una serie de retos prácticos. Así, se construyó un dispositivo HIFU a partir de un generador de onda cuadrada utilizando cuatro transistores de potencia con sus respectivos drivers, un oscilador de 1,22 MHz, un microcontrolador y diversos elementos pasivos. Este generador de ondas acepta una potencia de puente de transistor de hasta 200 W proporcionada por una fuente externa y suministra la excitación al transductor HIFU. El transductor HIFU es un casquete esférico PTZ-8 de 50,8 mm de radio de curvatura y 10 mm de profundidad de casquete que se basa en el efecto piezoeléctrico para convertir la excitación eléctrica de onda cuadrada en una oscilación mecánica, es decir, en ondas de presión, con amplitud proporcional a la raíz cuadrada de la potencia utilizada. La tapa está en una cámara sellada, descrita en la Fig. 2a. La frecuencia de resonancia de la tapa cerámica fue de 1,5 MHz, aunque se alimentó a una frecuencia más baja, como se ve en la salida del generador que se muestra en la Fig. 2b, para superar el posible cruce en los transistores del generador. El foco donde se concentra el ultrasonido, que depende de la forma y dimensiones del transductor, se determinó de forma independiente con tres métodos diferentes: por termografía con bolómetro, por termografía con película termosensible y con termopares. Las mediciones buscaron determinar la distancia en el eje z a la que se ubica el centro de la región focal. Para obtener valores precisos, se utilizaron los motores paso a paso de una impresora FDM CREALITY Ender 3-Pro para controlar la posición de la punta del termopar, con una precisión de 100 µm. Los experimentos térmicos realizados a diferentes distancias de la superficie de la tapa (ver Fig. S5) arrojaron una posición del foco a 50,8 mm con respecto a ésta, siendo este el punto de máximo calentamiento. Esto concuerda perfectamente con lo esperado según la geometría del transductor detallada anteriormente.

Caracterización del equipo de Ultrasonido Focalizado de Alta Intensidad. (a) Sección del transductor HIFU. A–D: chasis de PVC, para proporcionar estructura, estanqueidad y cámara de aire detrás del tapón; E: película conductora para la superficie exterior de la tapa; F: película conductora para la superficie interior de la tapa; G: sellador epoxi (externo e interno); H: cable coaxial de alimentación; J: cámara de aire; K: casquillo de bola de cerámica PTZ-8; L: tapón de drenaje de la cámara de aire en caso de infiltraciones. (b) Salida del generador de onda cuadrada, sin alimentación de la fuente externa. La frecuencia de la señal es de 1,22 MHz, con una amplitud de 18 V pico-pico. (c) Curvas de temperatura obtenidas calentando con HIFU a diferentes voltajes y corrientes de la fuente de alimentación externa. Los disparos se normalizaron para 60 s de exposición. Las tasas de calentamiento obtenidas dependieron del suministro de energía de la fuente externa. Como la potencia nominal del piezo es de 25W, operar por debajo de ella (caso de la curva para 20 V y 0,68 A) resulta en un rendimiento reducido. (d) Detalle de la región focal del calentamiento ultrasónico. La transferencia de calor es mayor en una región ovoide de dimensiones 12 × 15 mm. Estos valores se obtuvieron de los experimentos mediante termografía con película termosensible, cuyo ejemplo se muestra en (e). (e) Perfil termográfico de calentamiento con HIFU en agua a temperatura ambiente. El calentamiento produce, en la sección, círculos concéntricos respecto al foco. Entre el punto más caliente y el más frío siempre se registra una diferencia de temperatura inferior a \(10 \;^\circ{\rm C}\).

Con diferentes voltajes (en el rango de 20 a 60 V) y corrientes (en el rango de 680 mA a 2,26 A) de suministro de CC para el generador de ondas, el transductor obtuvo las curvas de calentamiento reflejadas en la Fig. 2c, variando la fuente de alimentación. Las velocidades de calentamiento alcanzadas por el dispositivo, en las diferentes potencias de suministro, estuvieron aproximadamente entre 14 y 218 \(^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\). A continuación, se caracterizó la forma de la región focal, como el volumen en el que en cualquier instante durante el recalentamiento, la diferencia máxima de temperatura entre dos puntos cualesquiera fue siempre menor que \(10 \; ^\circ{\rm C}\). Esto resultó en un ovoide de dimensiones 12,4 × 15,4 mm. Estos valores se pueden ver en las figuras 2d y e.

Para garantizar que toda la población de nematodos, empapada en la solución crioprotectora, quedara confinada dentro del foco ultrasónico, fue necesario criopreservarlos en un pequeño recipiente especialmente diseñado. Dicho recipiente consistía en un pozo hueco, construido dentro de una placa de Petri, utilizándose agar como relleno para el resto. Su detalle se muestra en la Fig. 3d. Se decidió que las dimensiones del pozo fueran de 9 mm de diámetro por 6 mm de profundidad, menor que las dimensiones del ovoide focal. Para asegurar la ausencia de fuga del medio crioprotector a través del agar, las paredes del pocillo se cubrieron con una película de alcohol isopropílico. La eficacia del tratamiento fue confirmada por experimentos de permeabilidad de estos pocillos, revelados por el paso -o no- de rojo fenol, como colorante, a través del agar. Estos pozos personalizados sirven simplemente como un contenedor de confinamiento adaptado a nuestra geometría; También se pueden utilizar materiales y formas alternativas, siempre que sean capaces de transmitir ultrasonido. Finalmente, antes de enfriar, las placas siempre se cerraron con su tapa y se sellaron con parafilm. Esto permite el uso de nuestra tecnología de acuerdo con las GMP, ya que la muestra está aislada. Para el recalentamiento con ultrasonido, se eligió etilenglicol como medio líquido para la transmisión de ondas sonoras desde el transductor a la muestra. Este medio puede mantener a los nematodos inicialmente en − \(80 \; ^\circ{\rm C}\) al permanecer en estado líquido incluso a temperaturas suficientemente bajas.

Historia térmica de la criopreservación de C. elegans y configuración experimental. (a) Curvas de temperatura durante el proceso de congelación lenta, el almacenamiento a \(- 80 \; ^\circ{\rm C}\) (representado por el "espacio" en el gráfico) y la recuperación mediante calentamiento HIFU. Las muestras comienzan a temperatura ambiente y, después de la incubación en solución crioprotectora durante 10 min, se colocan en el congelador a \(- 80 \; ^\circ{\rm C}\) para un enfriamiento a \(- 0,6 \; ^ \circ{\rm C} /\mathrm{min}\). Luego se almacenan durante 48 h y se recuperan mediante calentamiento por ultrasonidos directamente desde la temperatura de almacenamiento, hasta una temperatura de aproximadamente \(-5 \; ^\circ{\rm C}\). (b) Configuración experimental que muestra A: baño de etilenglicol en \(-70 \; ^\circ{\rm C}\); B: transductor HIFU; C: soporte de placa en PLA; D: Caja de Petri (con un pozo en el centro) cubierta, sellada con parafilm e invertida; E: termómetro externo; F: generador de onda cuadrada; G: fuente de alimentación externa. (c) Vista en sección 3D de la configuración experimental, modelada en CAD. En esta imagen se aprecia mejor la función del soporte y su uso. Las etiquetas se comparten con la imagen (b). (d) Detalle del pocillo de agar en una placa de Petri de 50 mm de diámetro. La placa se presenta invertida, que es como se coloca sobre el soporte 3D para ser expuesta al ultrasonido.

La necesaria inmersión del transductor HIFU por su parte cóncava en el baño generó frecuentemente una burbuja de aire indeseable. Estos se eliminaron mediante una ventosa de gas sumergida en etilenglicol. Finalmente, la repetibilidad de los experimentos y la estabilidad de la posición del foco con respecto a la muestra calentada se garantizaron con la construcción de un soporte de ácido poliláctico (PLA) impreso en 3D que aloja e inmoviliza de forma segura la placa de Petri y el transductor. Fabricado con técnicas CAD y FDM. Las Figuras 3b yc muestran la configuración experimental para el uso de HIFU con las placas fabricadas. Los detalles sobre los modos de falla y la practicidad de la calefacción se pueden encontrar en la Información complementaria.

El rendimiento físico de toda la configuración descrita anteriormente se modeló computacionalmente utilizando elementos finitos (Comsol Multiphysics v6.7), utilizando juntos los paquetes Acoustics y Heat Transfer. El resultado de estas simulaciones por ordenador corroboró tanto la posición del foco como sus dimensiones, así como las tasas de calentamiento encontradas experimentalmente. Los campos de presión y temperatura del sonido en una vista 2D del experimento se muestran en las figuras 4e yf, respectivamente. La Figura S10 proporciona una descripción general de los contornos isotérmicos durante una simulación de calentamiento de 60 s.

Presentación de resultados. (a) Supervivencia con HIFU según la tasa de calentamiento y el tiempo de exposición. Las bajas tasas de calentamiento muestran peores resultados en la recuperación de C. elegans. Los experimentos siempre se realizaron con placas que contenían grupos de nematodos \(\sim 200\). Estos mostraron la siguiente composición promedio: 20% individuos en estadio L1, 30% en L2, 25% en L3, 15% en L4 y 10% adultos. Para los parámetros óptimos, la supervivencia por etapas de crecimiento no fue homogénea, ya que se recuperaron más nematodos L1-L3 que L4 y adultos. La supervivencia de L4 fue del 70%. La supervivencia de los adultos estuvo entre el 40 y el 60%. (b) y (c) Muestre la supervivencia para las tasas de calentamiento más altas, \(157.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) y \(217.8 \;^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) , en función del tiempo de exposición. Los tiempos de exposición cortos (menos de 50 s) y excesivamente largos (más de 70 s) dieron como resultado tasas de supervivencia muy bajas. (d) Dependencia de la tasa de calentamiento para el tiempo de exposición óptimo. Para tasas de calentamiento bajas, la tasa de recuperación es cercana al 0%, alcanzando el 90% para las tasas de calentamiento más altas. Estos resultados hay que compararlos con el protocolo de Brenner, siendo sólo un 35% para los estadios más favorables (L1-L2) y cercano al 0% para los adultos. La línea discontinua no es una interpolación de resultados, sino una línea de tendencia. (e) Simulación de elementos finitos de la presión acústica en una sección 2D del experimento. La región de mayor presión acústica, 270 dB, se alcanza en el foco geométrico del transductor. (f) Simulación por elementos finitos del campo de temperatura. en una sección 2D del experimento, después de 60 s de exposición a HIFU. La temperatura más alta se alcanza en el foco. La placa de Petri se coloca invertida, representando el rectángulo negro el pocillo que contiene los gusanos, para evitar espacios de aire entre los ultrasonidos y los nematodos. (g) Nematodo muerto después de un recalentamiento insuficientemente rápido (\(<150 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\)). (h) Nematodos unas horas después de ser recuperados mediante calentamiento HIFU. Se aprecian todas las etapas de crecimiento. (i) Huevo de C. elegans después de la recuperación de los nematodos: su capacidad reproductiva se conserva después de la criopreservación y el recalentamiento con HIFU.

Superados todos los detalles y comprobaciones anteriores, pasamos a la fase experimental con C. elegans. Para ello, los nematodos fueron criopreservados siguiendo el protocolo estándar de Brenner53 mediante congelación lenta en glicerol al 15%, adaptado a nuestras necesidades. Se enfriaron poblaciones de aproximadamente 200 individuos de todas las etapas de crecimiento a −\(0,6 \; ^\circ{\rm C} /min\), hasta − \(80 \; ^\circ{\rm C}\), dentro de los pocillos construidos en las placas de Petri descritas anteriormente. La cantidad de hielo formado en este sistema se analiza en Información complementaria. Después de 48 h de almacenamiento a − \(80 \; ^\circ{\rm C}\), los nematodos se volvieron a calentar. Para cada experimento siempre hubo dos platos. La primera placa se recalentó con ultrasonidos, aplicándolos hasta que la temperatura del pocillo con los nematodos alcanzó alrededor de − \(5 \; ^\circ{\rm C}\) (temperatura que está por encima del punto de fusión de la solución). La evolución de la temperatura a lo largo del proceso se muestra en la Fig. 3a. La segunda placa se recalentó de la forma habitual: ya sea dejándola al aire (velocidad de calentamiento: \(\sim 10 \; ^\circ{\rm C}\)/min) hasta que la solución con los nematodos se había descongelado por completo , o sumergiéndolo en un baño de agua a \(37 \; ^\circ{\rm C}\) (tasa de calentamiento: \(\sim 93 \; ^\circ{\rm C}\)/min) durante 1 minuto. Después de recalentar, las lombrices se colocaron en un plato con comida. Finalmente, se observó la recuperación de estos analizando su movilidad inmediatamente después de depositarlos, su movilidad después de 24 h y su capacidad reproductiva.

Se realizaron un total de 53 experimentos HIFU con más de 10.000 nematodos. La tabla que se muestra en la Fig. 4a muestra la tasa de supervivencia según la tasa de calentamiento y el tiempo de exposición al ultrasonido. Todas las tasas de calentamiento en la Fig. 4 se midieron en el intervalo de − \(60\) a − \(40 \; ^\circ{\rm C}\). Se eligió este intervalo porque es la zona en la que el problema de recristalización puede ser más crítico43,54.

El transductor de ultrasonidos funcionaba con cuatro potencias diferentes: 13,6 W, 33,9 W, 90,5 W y 134,4 W. Parte de esta energía se disipaba en la electrónica. Las tasas de calentamiento asociadas, medidas por termopares, fueron \(14.2 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\), \(31.7 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min }\), \(157.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) y \(217.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\), respectivamente. No se pudieron explorar velocidades más altas, ya que esta última es la máxima que puede alcanzar nuestro sistema actual.

Antes de los resultados que se presentan a continuación, se llevaron a cabo una serie de experimentos preliminares y exploratorios, determinando la evidencia del beneficio de las altas tasas de calentamiento. Por esta razón, las tasas de calentamiento más altas se estudiaron posteriormente con más detalle: \(157.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) y \(217.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\). Para ellos se exploró un espectro de tiempos de exposición: 30 s, 40 s, 50 s, 60 s, 70 s y 80 s para \(157,8 \; ^\circ{\rm C} /min\) y 40 s, 50 s, 60 s, 70 s, 80 s y 90 s para \(217.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\). Los resultados de estos experimentos se muestran en las figuras 4b y c. En ambos casos se observa que el tiempo de exposición insuficiente o excesivo al HIFU fue fatal para la población en estudio.

En la Fig. 4b, correspondiente a una tasa de calentamiento de \(157,8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\), podemos ver que para exposiciones de menos de 30 s, 40 s y 50 s, la tasa de recuperación es del 0%. Se eleva durante 60 s, alcanza un máximo en 70 s, vuelve a descender por tiempos de exposición más prolongados y finalmente alcanza el 0% (no representado).

De manera similar, en la Fig. 4c, correspondiente a una tasa de calentamiento de \(217.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\), para exposiciones de menos de 40 s la tasa de recuperación es 0%. A medida que el tiempo de exposición aumenta a 40 s, 50 s y 60 s, la tasa de recuperación aumenta gradualmente, alcanzando un máximo de 70 s. A partir de ese valor del tiempo de exposición, la tasa de recuperación vuelve a caer hasta llegar a cero.

Finalmente, en la Fig. 4d, la supervivencia se representa frente a la tasa de calentamiento para los tiempos de exposición óptimos encontrados anteriormente. Este gráfico muestra cómo la tasa de supervivencia comienza prácticamente desde el 0% para las tasas de calentamiento más bajas, se eleva al 20% para las tasas de calentamiento intermedias (\(157.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\)) y finalmente alcanza el 90% para las tasas de calentamiento más altas (\(217.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\)).

Respecto a los adultos, para la configuración óptima, \(217.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\) y tiempo de exposición de 70 s, se dispusieron 3 placas. En cada una de ellas, como en el resto de placas de este estudio, había unos 200 gusanos, de los cuales unos 20 eran adultos. Luego de la aplicación de la ecografía se encontraron 7 adultos en el peor de los casos y 10 en el mejor de ellos, representando una tasa de supervivencia entre 40 y 50% para los adultos, respectivamente. Se pueden ver videos de los gusanos adultos recuperados en la Información complementaria (Fig. S11). Recuerde que la tasa de recuperación en adultos es cercana al 0% para el recalentamiento lento convencional.

Las Figuras 4g-i muestran, respectivamente, un detalle de un nematodo muerto por una tasa de calentamiento insuficiente, un grupo de nematodos de todas las edades después de recalentarse a \(217.8 \; ^\circ{\rm C} /\mathrm{min}\ ) durante 70 s, y un huevo puesto brevemente después de la recuperación del nematodo.

Para completar, las dos formas de recalentamiento estándar, en un baño a \(37 \; ^\circ{\rm C}\) y en el aire (temperatura ambiente: \(25 \; ^\circ{\rm C} \)), también fueron registrados. En el baño de agua la supervivencia fue del 0%, lo que concuerda con los hallazgos de Brenner23 (consulte la Información complementaria para conocer este resultado). En el caso del aire, la recuperación fue de alrededor del 35 % para L1-L2 y cercana al 0 % para los adultos, lo que también coincide con nuestros estudios recientes51.

Podemos concluir que estas observaciones prueban, por primera vez, la capacidad de los HIFU para alcanzar las tasas de calentamiento necesarias para evitar el problema de la recristalización en la criopreservación. Las ventajas de esta tecnología son varias: (1) no genera patrones estacionarios como las microondas, (2) no tiene el problema de fuga térmica, (3) puede usarse para muestras ya almacenadas con crioprotectores convencionales, (4) se puede monitorizar en tiempo real mediante resonancia magnética, (5) se puede controlar fácilmente mediante interferometría, (6) se utiliza de forma rutinaria en muchos otros campos, lo que representa un gran beneficio, y sobre todo (7) es escalable. Todo esto hace que este enfoque sea una herramienta prometedora, ya sea sola o junto con otras tecnologías emergentes como el nanocalentamiento39. Los próximos pasos posibles son aumentar el número de transductores, usarlos junto con la tomografía computarizada de rayos X para monitorear el campo CPA/hielo/fracturas y aplicarlos a sistemas que ya han mostrado cierto grado de éxito.

C. elegans se ha utilizado como modelo animal. Pensamos que es un sistema ideal, al tener un conjunto completo de órganos, siendo la base de importantes desarrollos en genética, biología del desarrollo, neurociencia u oncología, y una herramienta de trabajo para más de 500 laboratorios en todo el mundo. El uso del gusano aquí es sólo como prueba de principio; sin embargo, aun así, puede ser de interés per se para la conservación del estado adulto, para cepas que se congelan mal o para estructuras de tamaños similares como el embrión de Drosophila55. En cualquier caso, nuestra técnica ayuda en todas las situaciones en las que puede aparecer el omnipresente problema de la recristalización, incluida la criopreservación de órganos. De su aplicación en este campo se espera un cambio de paradigma y nuevas formas de bancarización de órganos y tejidos.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

Lewis, JK y cols. Los grandes desafíos de los bancos de órganos: Actas de la primera cumbre mundial sobre criopreservación de tejidos complejos. Criobiología 72, 169–182 (2016).

Artículo PubMed Google Scholar

Giwa, S. y col. La promesa de la preservación de órganos y tejidos para transformar la medicina. Nat. Biotecnología. 35, 530–542 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

de Vries, RJ et al. El sobreenfriamiento prolonga el tiempo de conservación del hígado humano. Nat. Biotecnología. 37, 1131-1136 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Fahy, GM Aspectos físicos y biológicos de la vitrificación renal. Organogénesis 5, 167-175 (2009).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Campbell, BK y cols. Restauración de la función ovárica y la fertilidad natural tras la criopreservación y el autotrasplante de ovarios completos de ovejas adultas. Tararear. Reproducción. 29, 1749-1763 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Luyet, BJ Vida y muerte a bajas temperaturas. Biodinámica (1940).

Polge, C., Smith, A. & Parkes, A. Reactivación de espermatozoides después de la vitrificación y deshidratación a bajas temperaturas. Naturaleza 164, 666 (1949).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Saenz, J., Toner, M. & Risco, R. Comparación entre modelos de soluciones ideales y no ideales para protocolos de criopreservación unicelular. J. Física. Química. B 113, 4853–4864 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Mazur, P. Criobiología: La congelación de sistemas biológicos. Ciencia 168, 939–949 (1970).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Farrant, J. Mecanismo de daño celular durante la congelación y descongelación y su prevención. Naturaleza 205, 1284-1287 (1965).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Fahy, GM, Wowk, B., Wu, J. & Paynter, S. Soluciones de vitrificación mejoradas basadas en la previsibilidad de la toxicidad de la solución de vitrificación. Criobiología 48, 22–35 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Warner, RM y cols. Cuantificación rápida de la toxicidad de múltiples crioprotectores mediante un método automatizado de manipulación de líquidos. Criobiología 98, 219–232 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Elford, BC y Walter, CA Efectos de la composición de electrolitos y el pH sobre la estructura y función del músculo liso enfriado a -79 grados C en medios no congelados. Criobiología 9, 82-100 (1972).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wu, K., Shardt, N., Laouar, L., Elliot, JAW y Jomha, NM Vitrificación de cartílago articular particulado mediante protocolos calculados. Regeneración NPJ. Medicina. 6, 15 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pegg, DE, Wang, L. y Vaughan, D. Criopreservación del cartílago articular. Parte 3: El método de seguimiento de liquidus. Criobiología 52, 360–368 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Rall, WF & Fahy, GM Criopreservación sin hielo de embriones de ratón a -196 °C mediante vitrificación. Naturaleza 313, 573–575 (1985).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Gallardo, M., Saenz, J. & Risco, R. Los ovocitos y cigotos humanos están listos para una vitrificación ultrarrápida después de 2 minutos de exposición a soluciones estándar de CPA. Ciencia. Rep. 9, 15986 (2019).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fahy, GM, MacFarlane, DR, Angell, CA y Meryman, HT La vitrificación como enfoque para la criopreservación. Criobiología 21, 407–426 (1984).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Lovelock, JE & Smith, AU Estudios sobre hámsteres dorados durante el enfriamiento y el recalentamiento desde temperaturas corporales inferiores a 0 grados C. III. Aspectos biofísicos y discusión general. Proc. R Soc. Londres. B Biol. Ciencia. 145, 427–442 (1956).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Leonel, ECR et al. Técnica de vitrificación escalonada para la criopreservación de tejido ovárico humano. Ciencia. Rep. 9, 20008 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boutron, P. & Kaufmann, A. Estabilidad del estado amorfo en el sistema agua-1,2-propanodiol. Criobiología 16, 557–568 (1979).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Risco, R., Elmoazzen, H., Doughty, M., He, X. & Toner, M. Rendimiento térmico de capilares de cuarzo para vitrificación. Criobiología 55, 222–229 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Brenner, S. La genética de Caenorhabditis elegans. Genética 77, 71–94 (1974).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mazur, P. & Seki, S. Supervivencia de ovocitos de ratón después de enfriarlos en una solución de vitrificación a -196 °C de 95 ° a 70 000 °C/min y calentarlos de 610 ° a 118 000 °C/min: un nuevo paradigma para criopreservación por vitrificación. Criobiología 62, 1–7 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Meneghel, J., Kilbride, P., Morris, JG y Fonseca, F. Eventos físicos que ocurren durante la criopreservación de células T humanas inmortalizadas. MÁS UNO 14(5), e0217304 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

MacFarlane, DR, Forsyth, M. Desvitrificación y recristalización de vidrio formando soluciones acuosas. En La biofísica de la criopreservación de órganos. Serie ASI de la OTAN, vol. 147 (Pegg, DE y Karow, AM eds) (Springer, 1987).

Boutron, P. Comparación con la teoría de la cinética y el grado de cristalización del hielo y de la tendencia a la formación de vidrio en soluciones crioprotectoras acuosas. Criobiología 23, 88-102 (1986).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Fahy, GM & Wowk, B. Principios de criopreservación por vitrificación. En Protocolos de criopreservación y liofilización. Métodos Mol Biol, vol. 1257 (eds. Wolkers, W. y Oldenhof, H.) 21–82 (2015).

Fahy, GM & Wowk, B. Principios de criopreservación por vitrificación. En Protocolos de criopreservación y liofilización. Métodos Mol Biol, vol. 1257 (Wolkers, W. y Oldenhof, H.) 21–82 (Springer, 2015).

Massie, I. et al. Criopreservación GMP de grandes volúmenes de células para medicina regenerativa: control activo del proceso de congelación. Ing. de Tejidos. Métodos de la Parte C 20, 693–702 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Baust, JM, Campbell, LH y Harbell, JW Mejores prácticas para criopreservar, descongelar, recuperar y evaluar células. Desarrollo de células in vitro. Biol. Animación. 53, 855–871 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Koshimoto, C. & Mazur, P. Efectos de la velocidad de enfriamiento y calentamiento desde y hacia -70 °C, y efecto de un enfriamiento adicional de -70 a -196 °C sobre la motilidad de los espermatozoides de ratón. Biol. Reproducción. 66, 1477-1484 (2002).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hunt, CJ Consideraciones técnicas en la congelación, almacenamiento a baja temperatura y descongelación de células madre para terapias celulares. Transfus Med. Hemadre. 46, 134-150 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Baboo, J. y col. El impacto de las diferentes tasas de enfriamiento y descongelación en la calidad de las células T de sangre periférica humana criopreservadas. Ciencia. Rep. 9, 3417 (2019).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Andjus, RK & Lovelock, JE Reanimación de ratas a partir de temperaturas corporales entre 0 y 1 grado C mediante diatermia por microondas. J. Physiol. 128, 541–546 (1955).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Marsland, TP, Evans, S. & Pegg, DE Mediciones dieléctricas para el diseño de un sistema de recalentamiento electromagnético. Criobiología 24, 311–323 (1987).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Fowler, AJ & Toner, M. Prevención de la hemólisis en eritrocitos congelados rápidamente mediante el uso de un pulso láser. Ana. N. Y Acad. Ciencia. 858, 245–252 (1998).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Wowk, B. & Corral, A. Adaptación de una máquina de diatermia comercial para el calentamiento por radiofrecuencia de órganos vitrificados. Criobiología 67, 404 (2013).

Artículo de Google Scholar

Manuchehrabadi, N. et al. Criopreservación de tejidos mejorada mediante calentamiento inductivo de nanopartículas magnéticas. Ciencia. Traducción Medicina. 9, 56 (2017).

Artículo de Google Scholar

Ren, S. y col. Desarrollo de una novedosa tecnología de recalentamiento electromagnético para la criopreservación de células madre de gran volumen. Perspectiva novedosa. Fabricación de células madre. Terapia. https://doi.org/10.5772/intechopen.94556 (2020).

Artículo de Google Scholar

Jin, B. & Mazur, P. Alta supervivencia de ovocitos/embriones de ratón después de la vitrificación sin crioprotectores penetrantes seguida de un calentamiento ultrarrápido con un pulso de láser IR. Ciencia. Rep. 5, 9271 (2015).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sharma, A. y col. Vitrificación y nanocalentamiento de riñones. Adv. Ciencia. 8(19), e2101691 (2021).

Artículo de Google Scholar

Wells, P. Ultrasonido biomédico (Academic Press, 1977).

Google Académico

Olmo, A., Barroso, P., Barroso, F. & Risco, R. El uso de ultrasonido enfocado de alta intensidad para el recalentamiento de material biológico criopreservado. Traducción IEEE. Ultrasonido. Ferroeléctrico. Frec. Controlar 68, 599–607 (2021).

Artículo PubMed Google Scholar

Wood, RW & Loomis, AL Los efectos físicos y biológicos de las ondas sonoras de alta frecuencia y gran intensidad. Instituto J. Franklin. 205, 151-153 (1928).

Artículo de Google Scholar

Lynn, JG, Zwemer, RL y Chick, AJ La aplicación biológica de ondas ultrasónicas enfocadas. Ciencia 96, 119-120 (1942).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Purcell, EM, Torrey, HC & Pound, RV Absorción de resonancia por momentos magnéticos nucleares en un sólido. APS 69, 37–38 (1946).

CAS Google Académico

Rieke, V. y Butts, termometría por resonancia magnética PK. J. Magn. Reson. Imágenes 27(2), 376–390 (2008).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Izadifar, Z., Izadifar, Z., Chapman, D. & Babyn, P. Introducción al ultrasonido focalizado de alta intensidad: revisión sistemática de principios, dispositivos y aplicaciones clínicas. J.Clin. Medicina. 9, 460 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Risco, R., Barroso, P., Cano-Chaichio, M. & Olmo, A. Termografía por resonancia magnética enfocada guiada por ultrasonido para el recalentamiento rápido y controlado de órganos criopreservados. Criobiología 85, 164–165.

Artículo de Google Scholar

Barranco, D. & Risco, R. El crioalmacenamiento a largo plazo no afecta negativamente la recuperación de Caenorhabditis elegans. Criobiología 109, 86–88 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Risco, R. & Toner, M. Microcapilares de cuarzo para vitrificación de C. elegans. Criobiología 57, 320–321 (2008).

Artículo de Google Scholar

Stiernagle, T. Mantenimiento de C. elegans. Libro de gusanos 1–11 (2006).

Hola, JM y Macfarlane, DR Cristalización de hielo en soluciones acuosas de glicerol y dimetilsulfóxido 2: cinética de crecimiento de cristales de hielo. Criobiología 37, 119-130 (1998).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Zhan, L., Li, M., Hays, T. y Bischof, J. Método de criopreservación para embriones de Drosophila melanogaster. Nat. Comunitario. 12, 2412 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Descargar referencias

Esta investigación fue parcialmente financiada por las subvenciones: Plan Propio de Investigación de la Universidad de Sevilla y Ministerio de Ciencia y Tecnología (España), AICIA, PEJUS-89 y EQC2019-005949. Agradecemos a Juan José Jiménez por su trabajo con la electrónica. También agradecemos a los revisores anónimos que ayudan a mejorar la calidad de este manuscrito.

Escuela Superior de Ingenieria, C/Camino de los Descubrimientos s/n, University of Seville, 41092, Seville, Spain

Enrique Alcalá, Laura Encabo, Fatima Barroso, Adriana Puentes & Ramon Risco

SafePreservation, C/Avda. De la Ciencias 55, 41020, Seville, Spain

isabel risco

Centro Nacional de Aceleradores-US, JA, CSIC, C/Tomas Alva Edison 7, 41092, Sevilla, España

Ramón Risco

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

RR e IR concibieron la idea de HIFU para evitar la recristalización; EA y LE llevaron a cabo el proceso de enfriamiento; EA y AP hicieron el rodaje con el ultrasonido; LE y FB mantuvieron los gusanos; EA hizo los diseños 3D; EA y AP tomaron la decisión de centrarse; EA realizó las simulaciones por computadora. LE y FB prepararon las soluciones; EA y LE fabricaron placas de agar especiales; EA llevó a cabo el análisis estadístico; EA, LE, IR y RR escribieron el artículo; EA, LE, IR y RR hicieron una lectura crítica del mismo; RR lideró el equipo.

Correspondencia a Ramón Risco.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Figura complementaria 10.

Figura complementaria 11.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Alcalá, E., Encabo, L., Barroso, F. et al. Ondas sonoras para solucionar el problema de la recristalización en criopreservación. Representante científico 13, 7603 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34681-z

Descargar cita

Recibido: 20 de diciembre de 2022

Aceptado: 05 de mayo de 2023

Publicado: 10 de mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34681-z

Cualquier persona con la que comparta el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.