Manejo libre de contaminación y arrastre de fluidos complejos usando lubricante

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 14486 (2022) Citar este artículo

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La contaminación cruzada de muestras biológicas durante la manipulación y preparación es un problema importante en las instalaciones de laboratorio, que genera falsos positivos o falsos negativos. Los residuos de muestras en las puntas de las pipetas contribuyen en gran medida a este problema. La mayoría de las puntas de pipeta del mercado están fabricadas con polímeros hidrofóbicos que son capaces de repeler líquidos de alta tensión superficial, pero carecen de rendimiento cuando se trata de líquidos de baja tensión superficial y fluidos viscosos. Además, la hidrofobicidad de las puntas de las pipetas puede provocar una adsorción hidrofóbica de biomoléculas, lo que provoca imprecisiones y pérdida de precisión durante el pipeteo. Aquí proponemos el uso de tecnología de superficie con infusión de lubricante (LIS) para lograr propiedades omnifóbicas en puntas de pipeta. Utilizando un diseño simple y versátil, el lumen interno de las puntas de pipeta disponibles comercialmente se recubrió con una capa de fluorosilano (FS) mediante deposición química de vapor (CVD). La presencia de grupos FS en las puntas se confirma mediante pruebas de espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) y espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR). Después de la lubricación de las puntas con un lubricante fluorado, la omnifobicidad y el comportamiento repelente de las puntas mejoran drásticamente, lo que se revela mediante mediciones de ángulo de contacto estático y de histéresis. La repelencia de las puntas de pipeta con lubricante frente a la adsorción física se investiga pipeteando un colorante alimentario y muestras de sangre humana y se compara con las puntas no tratadas. Los resultados muestran una cantidad significativamente menor de residuos residuales cuando se utilizan puntas con infusión de lubricante en comparación con las disponibles comercialmente. También demostramos que las puntas con infusión de lubricante reducen la contaminación bacteriana del lumen interno de 3 a 6 log (más del 99 %, dependiendo del tamaño de la punta) después de pipetear hacia arriba y hacia abajo la solución de bacterias.

El arrastre de fluido en los dispositivos de manipulación de líquidos puede provocar fallos en los experimentos, imprecisiones en las mediciones y pérdida de muestras. Es la principal causa de contaminación cruzada en procedimientos científicos generales como el trabajo bacteriológico, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el radioinmunoensayo1,2,3,4. Por ejemplo, en reacciones de amplificación por PCR en un laboratorio forense criminal, pequeñas cantidades de contaminación de ADN podrían dar como resultado una amplificación del ADN para promover identificaciones falsas positivas5. En tales casos, una causa subyacente de contaminación podría originarse al pipetear sustancias con alta viscosidad y bajas tensiones superficiales que pueden adherirse a la superficie plástica de la pipeta, lo que resulta en una eyección inadecuada sobre la siguiente muestra de prueba6,7,8. Además, la contaminación residual en el pipeteo puede provocar una determinación errónea del volumen, la necesidad de cambiar las puntas, la huella de carbono y los costos asociados con la eliminación de las puntas de un solo uso. Para minimizar sustancialmente el efecto del arrastre, las áreas de trabajo del laboratorio necesitan conjuntos separados de suministros y equipos, como pipetas, soportes para tubos de ensayo y centrífugas9,10,11. Generalmente se recomiendan puntas de un solo uso con filtro como principal estrategia para prevenir la contaminación originada por los amplicones que se acumulan dentro de la pipeta10,12,13,14. Sin embargo, las puntas de un solo uso no son aplicables a las estaciones de trabajo robóticas automatizadas que utilizan puntas fijas15. Actualmente se han implementado técnicas para la prevención de la contaminación cruzada, mediante el aumento del espaciamiento entre pozos y la prevención de movimientos involuntarios del eje Z desde la pinza robótica durante la transferencia de placas10,16. Además, la literatura actual sugiere que las puntas fijas tratadas con rutinas de lavado estrictas pueden servir como una alternativa viable y eficaz a las puntas desechables16. La cuestión de la contaminación por arrastre se puede ampliar a otras formas de equipos de laboratorio, como las jeringas y agujas utilizadas para la eliminación de productos de PCR en el brazo robótico de los sistemas de amplificación automatizados17. Una posible solución implicaría modificaciones en la superficie del equipo de laboratorio, concretamente puntas de pipeta, de modo que se pueda minimizar el problema del arrastre de muestras.

La mayoría de las puntas de pipeta del mercado están fabricadas con polímeros hidrofóbicos que repelen líquidos de alta tensión superficial como el agua. Uno de los polímeros más utilizados para moldear puntas de pipeta es el polipropileno debido a su hidrofobicidad, rentabilidad y disponibilidad. Si bien las superficies hidrófobas y superhidrófobas son útiles para repeler líquidos de alta tensión superficial, carecen de rendimiento cuando se utilizan líquidos con baja tensión superficial o alta viscosidad. La adsorción hidrófoba de biomoléculas en las puntas también puede provocar imprecisiones y pérdida de muestra durante el pipeteo18.

Para abordar este problema, la superficie de la punta debe volverse omnifóbica para repeler diferentes tipos de líquidos y biofluidos a pesar de sus fuerzas de cohesión19,20,21. Una histéresis de ángulo dinámico bajo y un ángulo de deslizamiento bajo son generalmente característicos de las superficies omnifóbicas22,23,24,25,26. Las superficies omnifóbicas se pueden fabricar utilizando dos técnicas generales: modificaciones físicas y químicas19,27,28,29,30,31,32,33. La modificación física implica hacer rugosa la superficie utilizando métodos como la deposición de nanopartículas, la impresión litográfica y el grabado34,35,36. La modificación química se basa en la disminución de la energía libre de la superficie de interés1,19,20,37,38,39,40,41. Se conocen varias técnicas de modificación de superficies que se basan en alterar la química de la superficie; algunas de las más frecuentes incluyen el uso de compuestos de fluorocarbono u organosilanos como recubrimientos de superficie21,34,42,43,44.

La creciente demanda de puntas de pipeta con una mínima adherencia a la superficie de la muestra ha llevado al desarrollo de puntas de pipeta de baja retención. Las puntas de pipeta de baja retención exhiben propiedades superficiales omnifóbicas, lo que conduce a una pérdida mínima de muestra. Un ejemplo implica el uso de procesos de moldeo únicos para incorporar moléculas de fluoropolímero en la superficie de las puntas de las pipetas para lograr propiedades hidrófobas45. Texturizar las puntas de las pipetas es otra técnica utilizada por los investigadores para recubrirlas hidrofóbicamente46,47. Estos métodos, sin embargo, presentan aspectos negativos tales como una mayor complejidad de fabricación, un alto coste y una menor eficacia en comparación con el recubrimiento de superficies.

Aquí, proponemos un proceso simple y rentable que comprende la fluorosilanización de puntas de pipeta mediante el método de deposición química de vapor (CVD) seguido de lubricación para generar puntas con infusión de lubricante con propiedades omnifóbicas. La capa de fluorosilano (FS) y la omnifobicidad de las puntas infundidas con lubricante se han caracterizado mediante espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS), espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR), así como mediciones de ángulos de contacto estáticos y de histéresis. La eficacia de las puntas modificadas para prevenir el arrastre de residuos se demuestra pipeteando diferentes soluciones, como colorantes alimentarios, sangre humana recalcificada y soluciones bacterianas.

Tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano (TPFS), perfluoroperhidrofenantreno (PFPP), caldo de soja tríptico (TSB) (Sigma, Oakville, Canadá), puntas de pipeta compuestas de polipropileno (Diamed Lab Supplies Inc., Mississauga, Canadá), colorante alimentario rojo (un producto de calidad Preema, ingredientes: cloruro de sodio y carmosina E122) y tween 20 (Sigma, Oakville, Canadá) se utilizaron tal como se recibieron. La sangre humana citrada se generó a partir de muestras de sangre extraídas de donantes sanos. Todos los procedimientos fueron aprobados por la Junta de Ética en Investigación de la Universidad McMaster. Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los donantes.

Las puntas de pipeta se colocaron en una rejilla para puntas y se colocaron en un limpiador de plasma (PE-100, Plasma Etch). Las puntas se trataron con plasma a radiofrecuencia (RF) de 150 kHz a 25 °C durante 2 minutos utilizando oxígeno gaseoso. Tras el tratamiento con plasma de oxígeno, las puntas de las pipetas se colocaron en un desecador conectado a una bomba de vacío. Se pipetearon 200 µl de TPFS sobre un portaobjetos de vidrio en una placa de Petri separada ubicada frente a la rejilla de puntas de pipeta. Además, también se pipetearon 100 µl de TPFS en un portaobjetos de vidrio ubicado dentro de la gradilla (Fig. 1). El desecador se aspiró a una presión de -0,08 MPa, iniciando así el tratamiento CVD. La reacción de silanización tuvo lugar durante un período de 2,5 h a temperatura ambiente. Una vez finalizada la CVD, las puntas de las pipetas se trataron térmicamente a 60 °C durante la noche. Para infundir lubricante en las puntas de pipeta fluorosilanizadas, simplemente se pipeteó dentro y fuera el lubricante PFPP, después de lo cual, las puntas se lavaron minuciosamente con agua desionizada (DI) para eliminar la cantidad extra de lubricante, dejando una fina capa de lubricante bloqueada. a los grupos FS a través de las fuerzas de Van der Waals.

Ilustración esquemática del procedimiento de tratamiento junto con las estructuras químicas de las puntas tratadas en cada paso de la modificación. Las puntas de las pipetas se trataron con plasma de oxígeno seguido de un tratamiento CVD con TPFS y un tratamiento térmico a 60 °C durante la noche. Posteriormente, las puntas se lubricaron mediante pipeteo dentro y fuera de lubricante PFPP. La capa lubricante puede repeler diferentes tipos de biomoléculas y soluciones, mientras que en las puntas disponibles comercialmente (puntas sin tratar), las biomoléculas y los reactivos pueden adherirse al lumen interno de las puntas provocando imprecisiones en volúmenes y concentraciones.

Se utilizó FTIR (Bruker, Karlsruhe, Alemania) para evaluar la composición química de la superficie de las puntas de pipeta antes y después del tratamiento. Durante las mediciones FTIR, el aire se consideró el fondo y los demás espectros de las superficies de las puntas fluorosilanizadas y no tratadas se normalizaron en función de esta línea de base. Se empleó espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) (PHI Quantera II, Biointerfaces Institute, McMaster University) para exhibir aún más la capa FS formada en las puntas de las pipetas. Cabe mencionar que la prueba XPS se realizó dos semanas después de la preparación de las puntas para asegurar la estabilidad de la capa FS de las puntas. Se realizó XPS de alta resolución para medir las concentraciones atómicas % de C, O, Na, Si, S y F. Antes de los análisis FTIR y XPS, se cortaron puntas de pipeta para exponer la superficie interna para las pruebas y se lavaron minuciosamente con etanol. .

Los ángulos de contacto de los fluorosilanizados y no tratados se midieron utilizando gotitas de 5 µl de agua, tween 20 e isopropanol. Las mediciones del ángulo de contacto de la gota sésil de agua se realizaron a temperatura ambiente antes y después de cada paso de modificación utilizando un goniómetro Future Digital Scientific OCA20 (Garden City, NY), que se calibró antes de cada medición. El ángulo de contacto de histéresis se llevó a cabo en las puntas infundidas con lubricante y en las puntas no tratadas utilizando el método de la aguja, donde la aguja se acercó a la punta y se midieron los ángulos de contacto de avance y retroceso mientras la gota se inyectaba y se retiraba de la superficie.

Cabe señalar que todas las pruebas de caracterización se realizaron en la luz interna de las puntas de 1 ml cortándolas en trozos pequeños y exponiendo la superficie interna. Para cada prueba de caracterización se consideraron 3 réplicas.

La estabilidad del lubricante dentro de las puntas se investigó midiendo el peso de las puntas en puntas P200 después de pipetear 200 µL de lubricante hacia arriba y hacia abajo, lavar para eliminar el exceso de lubricante, así como pipetear 3 y 20 veces hacia arriba y hacia abajo. hacia abajo agua DI mientras la pipeta estaba fijada a 200 l.

En los experimentos con tinte, se realizaron diluciones en serie 10X del tinte rojo en una placa de pocillos para evaluar el arrastre de las puntas tratadas. La concentración inicial del colorante fue de 1 mg mL-1. El tinte se diluyó en serie en agua que contenía 0,05 % de tween 20 utilizando puntas con lubricante infundido y sin tratar para comparar. A los efectos de la evaluación del remanente, las puntas de pipeta durante las diluciones en serie no se cambiaron y se implementó la misma punta de pipeta en todos los pasos de dilución. La placa de pocillos se analizó utilizando un lector de placas (Tecan Infinite M1000) para encontrar los valores de absorbancia.

La interacción entre los componentes sanguíneos y las puntas con lubricante se evaluó con sangre recalcificada. La sangre humana citrada se recalcificó con CaCl2 diluido en HEPES a una concentración de 12,5 mM. Para obtener imágenes con microscopio electrónico de barrido (SEM) (JSM‐7000 F), después de pipetear hacia arriba y hacia abajo la sangre recalcificada, las puntas se cortaron y fijaron usando glutaraldehído al 2% diluido en PBS. Luego, las puntas se incubaron en tetróxido de osmio al 1% en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M durante una hora, seguido de deshidratación mediante una serie graduada de etanol y secado en el punto crítico con un secador Leica EM CPD300 (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Austria) utilizando CO2 líquido. enjuagar. Antes de obtener imágenes, las muestras fueron pulverizadas con oro (recubrimiento por pulverización catódica Polaron Modelo E5100, Watford, Hertfordshire). Se lograron imágenes SEM de alta resolución de las puntas después de la fluorosilanización mediante JEOL JSM-7000F. Las muestras se cortaron y montaron en un trozo usando cinta de carbón y pasta de plata, luego se recubrieron usando un recubridor por pulverización catódica (Polaron modelo E1500, Polaron Equipment Ltd., Watford, Hertfordshire) con 10 nm de platino para SEM.

El ensayo de crecimiento bacteriano se realizó mediante estrías de Staphylococcus aureus USA300 JE2 (MRSA)48 sobre agar LB congelado y se dejó crecer durante la noche a 37 °C. Luego, los cultivos nocturnos se diluyeron en caldo de soja tríptico (TSB) suplementado con 0,4 % de glucosa y 3 % de NaCl49. Luego se prepararon suspensiones bacterianas concentradas de MRSA con una concentración de 107 UFC ml-1. Las puntas no tratadas se inocularon con MRSA pipeteando la suspensión bacteriana hacia arriba y hacia abajo, mientras que las puntas tratadas se lubricaron inicialmente y luego se lavaron 20 veces con agua desionizada antes de la inoculación con la suspensión bacteriana. A continuación, las puntas se incubaron con agitación durante 20 min en tubos que contenían 5 ml de TSB a 37 °C. De esta solución, se tomaron 100 µL de cada muestra agitada con vórtice para realizar un ensayo de UFC colocando diluciones en serie en placas de Petri con agar TSB. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba ANOVA.

Para cubrir uniformemente la superficie interna de las puntas de pipeta compuestas de polipropileno con grupos FS, las puntas se trataron primero con plasma de oxígeno durante 2 minutos y luego se fluorosilanizaron con CVD durante 2,5 h usando una solución TPFS. Durante este proceso, los terminales hidrófilos (triclorosilano) de las moléculas de fluorosilano se unen a los hidroxilos inducidos por plasma en la superficie de las puntas, lo que da como resultado monocapas autoensambladas (SAM) de FS con una estructura en forma de paraguas de manera que los terminales de flúor se unen. expuestos en la superficie (Fig. 1).

Para analizar los cambios en la composición química de las puntas de pipeta tratadas con FS, se realizó una prueba XPS en la superficie interna de puntas de pipeta fluorosilanizadas y sin tratar (Fig. 2a). Los picos surgidos a aproximadamente 35 eV, 690 eV y 830 eV en los espectros fluorosilanizados se atribuyen a los enlaces F2, F1 y F KLL, respectivamente. Estos picos indican la formación de una capa de FS dentro de las puntas utilizando nuestro método CVD desarrollado. La Figura 2b revela las concentraciones atómicas de los elementos presentes en la superficie interna de puntas fluorosilanizadas y sin tratar, utilizando XPS de alta resolución. Después de la fluorosilanización, la concentración de F, Si y O aumentó de 0 a 28,3%, de 1,2 a 4,7% y de 7,7 a 13,8, respectivamente. Esto ilustra claramente la existencia de grupos de cola de fluorosilano como resultado de la formación de FS SAM durante el proceso CVD. Es de destacar que las concentraciones atómicas de C e impurezas como Na disminuyeron debido al grabado con plasma de las puntas y a la ruptura de los enlaces químicos en la superficie.

Caracterización de las puntas tratadas con FS y estabilidad del lubricante. (a) Espectros XPS de puntas no tratadas y puntas fluorosilanizadas. La aparición de picos F2, F1 y F KLL está asociada con la formación de una capa de FS dentro de las puntas. (b) Las concentraciones atómicas (%) de diferentes elementos en la superficie interna de puntas no tratadas y fluorosilanizadas resultaron del análisis XPS de alta resolución. (c) Espectros FTIR de puntas de pipeta no tratadas versus puntas fluorosilanizadas. El pico ancho rodeado por un círculo en la región de 3700 a 3200 cm-1 indica la presencia de enlaces Si-OH. (d) Peso del lubricante en las puntas después de la lubricación, después de lavar el exceso de lubricante y después de pipetear agua DI 3 y 20 veces. La cantidad de lubricante permaneció sin cambios en las puntas después de múltiples pipeteos. Los resultados se presentan como medias ± DE

También realizamos una prueba FTIR para confirmar aún más la formación de una capa de FS dentro de las puntas (Fig. 2c). Los espectros de las puntas tanto fluorosilanizadas como sin tratar tuvieron una serie de picos en la banda de absorción entre 800 y 1200 cm-1, específicamente en vibraciones de 850 cm-1, 1000 cm-1 y 1200 cm-1 que son picos característicos del polipropileno isotáctico. . Estas bandas de absorción pueden interpretarse como vibraciones de los grupos C – H, CH2 y CH3 en la cadena polimérica50. Sin embargo, en las puntas fluorosilanizadas, hay una amplia banda de absorbancia alrededor de 3700-3200 cm-1. Esto podría corresponder a alcoholes y fenoles formados como resultado del tratamiento con plasma y la hidrólisis de las moléculas de TPFS50. Debido a la profundidad de penetración relativamente grande en FTIR, no pudimos demostrar con precisión los enlaces relacionados con FS SAM mediante este método.

Después de la fluorosilanización de las puntas, se lubricaron simplemente pipeteando dentro y fuera un lubricante fluorado (PFPP). Luego se eliminó el exceso de lubricante lavando exhaustivamente las puntas con agua desionizada. La fina capa restante de lubricante podría quedar fijada dentro del FS SAM mediante fuerzas de Van der Waals. Esta capa lubricante proporciona propiedades omnifóbicas y repelencia en el lumen interno de las puntas impregnadas de lubricante. Sin embargo, el lubricante debe permanecer en la punta después de pipetear productos químicos para preservar la omnifobicidad. Teniendo en cuenta varios estudios sobre la inestabilidad de la capa lubricante27,51,52,53, decidimos evaluar la robustez de las puntas infundidas con lubricante mediante una prueba de pesaje. Como se puede observar en la Fig. 2d, después de la lubricación de las puntas, el peso del lubricante fue de 6,9 mg. Cuando se lavaron las puntas y se eliminó el exceso de lubricante, el peso del lubricante restante dentro de la punta se redujo a 4,5 mg. Esta cantidad de lubricante era muy estable dentro de la punta, ya que después de pipetear agua desionizada 20 veces, el peso del lubricante en las puntas permaneció sin cambios. Esto también prueba que el lubricante no se introducirá en la solución pipeteada cuando se utilicen puntas con infusión de lubricante. Teniendo en cuenta la superficie lubricada de la punta y el peso y la densidad del lubricante PFPP (2,03 g/ml a 20 °C), calculamos que el espesor de la capa de lubricante es de aproximadamente 7 μm.

En particular, según el análisis de energía libre de Gibbs, el lubricante PFPP podría extenderse naturalmente y formar una capa lubricante incluso sin la presencia de FS SAM27. Sin embargo, nos dimos cuenta de que el lubricante en la superficie de las puntas no tratadas es significativamente menos estable que el de las puntas fluorosilanizadas. La Figura 1S muestra el peso del lubricante restante en las puntas sin tratar después de pipetear 20 veces hacia arriba y hacia abajo con agua DI. El menor peso de lubricante en las puntas sin tratar indica que el lubricante se eliminó parcialmente de la punta durante el proceso de lavado prolongado. Esto podría deberse a la ausencia de una capa de flúor y a la falta de fuerzas de Van der Waals para fijar el lubricante en la superficie de las puntas no tratadas. El lubricante restante en el lumen interno de las puntas no tratadas sugiere que las puntas lubricadas sin tratar podrían suprimir potencialmente los residuos arrastrados en las puntas hasta cierto punto, eliminando la necesidad de fluorosilanización. No obstante, sin fluorosilanización, el lubricante podría ser estable durante un período corto de tiempo y, para aplicaciones a largo plazo, se requiere tratamiento FS.

Para examinar la hidrofobicidad/hidrofilicidad relativa de las puntas de pipeta tratadas y no tratadas, se realizaron mediciones del ángulo de contacto utilizando una gota de 5 µl de agua desionizada. Las mediciones del ángulo de contacto estático de las puntas no tratadas, las puntas fluorosilanizadas y las puntas con infusión de lubricante se muestran en la Fig. 3a. Las puntas no tratadas demostraron un ángulo de contacto más bajo de 75 ± 11°, lo que implica bajos niveles de hidrofobicidad. Vale la pena señalar que el valor de la desviación estándar de las muestras no tratadas es relativamente alto debido a la variación en las propiedades superficiales de las puntas disponibles comercialmente. Tras el tratamiento CVD y antes de la adición de lubricante, el ángulo de contacto aumentó a 89 ± 3°. Finalmente, después de agregar lubricante PFPP a las puntas fluorosilanizadas, se demostró que los ángulos de contacto del agua aumentaban a 101,7 ± 7°.

Mediciones de ángulos de contacto. (a) Medición del ángulo de contacto estático de muestras de punta de pipeta lubricadas, fluorosilanizadas y sin tratar. (b) Histéresis del ángulo de contacto de puntas no tratadas y con infusión de lubricante. (c) Comparación del ángulo de contacto estático entre agua, interpolación 20 e isopropanol medido utilizando presión capilar. Todos los resultados se presentan como medias ± DE

En las mediciones del ángulo de contacto, se abrieron las puntas y la medición se realizó en el área cóncava para evaluar la hidrofobicidad de la luz interna. Debido a la curvatura de la superficie de la punta de la pipeta, medir el ángulo de contacto de una gota de líquido en la punta usando un tensiómetro presenta complicaciones y puede resultar en una ligera imprecisión. Como tal, el ángulo de contacto del agua, la interpolación de 20 y el isopropanol como líquido de baja tensión superficial se midieron en puntas de pipeta tratadas y estándar utilizando el método de ascenso capilar. El ascenso capilar se puede utilizar para calcular el ángulo de contacto del líquido que sube/baja utilizando principios hidrostáticos. Debido al gran parecido de las puntas con la forma de un cono truncado, la ecuación de ascenso capilar se modificó para tener en cuenta dicha forma capilar (Ec. 1):

donde θ es el ángulo de contacto, ρ es la densidad del líquido, g es la constante gravitacional, h es la altura de subida/caída, R es el diámetro del tubo en la región trifásica, γ es la tensión superficial del líquido , y β es el ángulo cónico de la punta.

Como tal, se adquirieron los ángulos de contacto de líquidos con diversas tensiones superficiales en las puntas fluorosilanizadas y sin tratar para probar el efecto de la modificación de la superficie sobre las propiedades omnifóbicas de las puntas (Fig. 3c). Los ángulos de contacto de los tres líquidos fueron mayores en las puntas fluorosilanizadas en comparación con las puntas no tratadas. Esto es especialmente evidente para los líquidos de menor tensión superficial como el tween 20 y el isopropanol. El aumento en los ángulos de contacto de las muestras tratadas resalta la mayor repelencia superficial inducida por el tratamiento. El ángulo de contacto del tween 20 fue 30° mayor en la superficie fluorosilanizada en comparación con el estándar, mientras que el del isopropanol fue 28° mayor. Dado que las puntas exhibieron propiedades hidrofóbicas incluso antes del tratamiento de la superficie debido a las propiedades del material utilizado para fabricar las puntas, hubo una diferencia menor en el ángulo de contacto del agua en la superficie tratada con un aumento de 6,9° usando el método de elevación capilar y 40° aumentar utilizando el tensiómetro óptico. Es de destacar que la naturaleza hidrófoba de las puntas de pipeta intactas no se apreció completamente en la Fig. 3a, lo que podría deberse al hecho de que las propiedades de la superficie de las puntas cambiaron un poco cuando las puntas se cortaron y aplanaron para medir el ángulo de contacto.

La fuerza de retención de caída en la superficie de las puntas modificadas se evaluó mediante mediciones del ángulo de contacto por histéresis (Fig. 3b). Ejercitamos el método de la aguja para evaluar el ángulo de contacto dinámico debido a la curvatura de las puntas. Mientras que la histéresis del ángulo de contacto de las puntas no tratadas fue de aproximadamente 17 ± 2,5°, la histéresis del ángulo de contacto de las puntas con infusión de lubricante alcanzó hasta 3,5 ± 0,6°, lo que muestra un gran comportamiento repelente de las puntas desarrolladas.

Como las puntas con infusión de lubricante desarrolladas pretenden ser versátiles y simples, evaluamos la posibilidad de incorporar un tratamiento con plasma de aire en lugar de un tratamiento con plasma de oxígeno en el proceso de fluorosilanización. Las puntas se trataron con plasma al aire durante 5 minutos y posteriormente se trataron con FS CVD durante 2,5 h seguido de un tratamiento térmico a 60 °C durante la noche. Los ángulos de contacto de las puntas fluorosilanizadas mediante tratamiento con plasma de aire se comparan con el tratamiento con plasma de oxígeno en la Fig. 2S. Los ángulos de contacto obtenidos de ambos protocolos de tratamiento con plasma fueron idénticos, lo que sugiere que el tratamiento con plasma de aire, que es sustancialmente más accesible que el tratamiento con plasma de oxígeno en diferentes laboratorios, puede sustituirse perfectamente en nuestro protocolo de fluorosilanización.

Estudios recientes han documentado que las capas texturizadas de fluorosilano son más efectivas para retener el lubricante54. Realizamos un SEM con grandes aumentos para investigar el efecto de la fluorosilanización en la topografía de la superficie de las puntas de las pipetas (Fig. 3S). Los resultados no mostraron ninguna diferencia significativa en la textura de las puntas no tratadas en comparación con las puntas fluorosilanizadas producidas mediante tratamiento con oxígeno o plasma de aire antes de la fluorosilanización. Por lo tanto, el recubrimiento texturizado FS SAM no se pudo generar mediante nuestra estrategia propuesta.

Para cuantificar la eficacia de las puntas con infusión de lubricante para prevenir el arrastre de residuos y la contaminación cruzada durante el pipeteo, se realizaron diluciones en serie diez veces de 1 mg ml-1 de un colorante alimentario en agua que contenía 0,05 % de tween 20 usando infusión de lubricante y sin tratar. consejos. Se utilizó la misma punta de pipeta para realizar todos los pasos de dilución para ilustrar mejor el efecto del residuo de tinte dentro de la punta durante las diluciones en serie. Utilizando mediciones de absorbancia (a la longitud de onda de 512 nm), cuantificamos los resultados obtenidos de puntas de pipeta sin tratar y con infusión de lubricante en dos tamaños de 10 μL y 200 μL que se muestran en las figuras 4a y b, respectivamente. Los resultados de las diluciones indican que las puntas no tratadas tienen residuos residuales significativamente mayores y las diluciones no se produjeron de manera eficiente. Por lo tanto, la mayor cantidad de tinte que se ve en concentraciones más bajas podría deberse al residuo de tinte que permaneció en la superficie de la punta desde las altas concentraciones iniciales y fue transportado a las bajas concentraciones.

Absorbancia del tinte rojo en diferentes concentraciones después de realizar diluciones en serie diez veces utilizando (a) puntas sin tratar de 10 µL y (b) 200 µL en comparación con las puntas con infusión de lubricante fluorosilanizado. Para cada experimento se utilizó una única punta para todas las diluciones en serie. La línea discontinua en (a) representa la absorbancia a concentración cero del tinte rojo. Los resultados se presentan como medias ± DE (c) Diluciones en serie del tinte rojo en una placa de pocillos utilizando puntas individuales de 10 μl sin tratar y con infusión de lubricante. Los pocillos no tratados mostraron un mayor arrastre de residuos de tinte, ya que la dilución no se produjo de manera efectiva. (d) Comparación del accesorio de tinte rojo con puntas no tratadas de 200 μl y puntas con infusión de lubricante fluorosilanizado.

Según las Fig. 4a, b, las puntas con infusión de lubricante muestran una disminución más pronunciada en la absorbancia por número de dilución seguida de una nivelación más rápida al valor de absorbancia del diluyente (con concentración cero del tinte) que se indica con la línea discontinua en la Fig. 4a. Por otro lado, las puntas sin tratar revelan niveles de absorbancia más altos incluso para números de dilución más altos, lo que es el resultado de que la muestra se adhiere a la pared de la punta incluso después de realizar varias diluciones. Además, se observa una variación significativamente mayor con las puntas no tratadas en comparación con las tratadas, como lo indican las grandes barras de error que se muestran en las figuras 4a, b. En la Fig. 4c, se pudo observar la diferencia de color en la placa de pocillos después de realizar las diluciones en serie mediante las puntas con infusión de lubricante y las puntas sin tratar. También realizamos una prueba visual en las puntas después de pipetear dentro y fuera el colorante alimentario diluido en agua que contenía 0,05% de tween 20 a una concentración de 1 mg mL-1. Como se muestra en la Fig. 4d, la punta de pipeta de 200 μL sin tratar mostró una gran cantidad de adsorción de tinte en la punta, mientras que la punta con infusión de lubricante mantuvo una cantidad significativamente menor de tinte principalmente en el extremo inferior de la punta después de pipetear la solución de tinte. .

En el siguiente experimento, utilizamos puntas con infusión de lubricante en diferentes tamaños de 10 μL (P10), 200 μL (P200) y 1 ml (P1000) para pipetear dentro y fuera de sangre humana citratada recalcificada. Como se demuestra en la Fig. 5a, las puntas con infusión de lubricante en todos los tamaños podrían suprimir eficazmente la adhesión de la sangre y la formación de coágulos dentro de la punta en comparación con las puntas no tratadas. Las imágenes SEM en la Fig. 5b también muestran la presencia de células sanguíneas y coágulos en la superficie de las puntas no tratadas, mientras que la modificación con infusión de lubricante redujo significativamente la unión celular y la formación de coágulos. Cuantificamos la cantidad de coágulo formado dentro de las puntas midiendo el peso del coágulo. La Figura 5c muestra que el peso del coágulo fue significativamente menor en las puntas con infusión de lubricante P1000 y P200 en comparación con las puntas sin tratar. Debido a la limitación de la sensibilidad de la báscula, no pudimos medir el peso del coágulo en puntas de 10 uL. En general, los resultados muestran que las puntas con lubricante son capaces de repeler todas las células sanguíneas, factores de coagulación y otras especies biológicas presentes en la sangre total humana.

(a) Comparación del accesorio de coagulación de la sangre con puntas no tratadas de 10 μL (P10), 200 μL (P200) y 1000 μL (P1000) y puntas con infusión de lubricante fluorosilanizado después de pipetear sangre humana recalcificada. (b) Imágenes SEM del coágulo adherido a la superficie de la punta no tratada en comparación con la punta con infusión de lubricante fluorosilanizado. (c) Peso del coágulo en las puntas sin tratar y con infusión de lubricante en dos tamaños de P200 y P1000. La cantidad de coágulo en las puntas con infusión de lubricante fue significativamente menor que en las puntas no tratadas (*P <0,001). Los resultados se presentan como medias ± DE (d) Representación esquemática del ensayo de bacterias. Después de pipetear hacia arriba y hacia abajo la suspensión de bacterias MRSA utilizando puntas sin tratar y con infusión de lubricante, las puntas se incubaron en medio TSB durante 20 minutos. (e) Resultados del ensayo de crecimiento bacteriano obtenidos a partir del medio TSB en el que se incubaron las puntas. Hay una diferencia significativa en UFC/ml de MRSA entre las puntas sin tratar y las con infusión de lubricante para los tres tamaños de P10, P200 y P1000 (*P < 0,001). Los resultados se presentan como medias ± SEM.

Finalmente, utilizamos nuestras puntas con infusión de lubricante para pipetear la solución de bacterias MRSA a una concentración de 107 UFC ml-1. Después de pipetear hacia arriba y hacia abajo la suspensión de bacterias usando puntas con infusión de lubricante y sin tratar, las puntas se sumergieron en 5 ml de TSB y se incubaron en una incubadora con agitación durante 20 minutos a 37 ° C (Fig. 5d). Además, el ensayo de UFC se realizó utilizando las soluciones de TSB para comparar la cantidad de bacterias adheridas a las puntas con infusión de lubricante y a las puntas sin tratar. Los resultados del ensayo de crecimiento (Fig. 5e) mostraron una reducción de aproximadamente 2 log, 3 log y 6 log en UFC/ml de MRSA mediante el uso de puntas con infusión de lubricante P10, P200 y P1000, respectivamente. Las puntas con infusión de lubricante pudieron repeler la mayoría de las bacterias MRSA cuando se pipeteó la solución de bacterias y solo quedaron unas pocas bacterias en la punta (Fig. 5d). El resultado de este estudio revela que una gran cantidad de bacterias se adhieren físicamente a las puntas disponibles comercialmente durante el pipeteo de suspensiones de bacterias, lo que puede provocar variaciones en la concentración de bacterias de la solución pipeteada y provocar errores experimentales.

La adherencia de la muestra a la pared de la punta durante las actividades de pipeteo introduce muchos problemas que reducen la precisión experimental. Las técnicas actuales para reducir este efecto son costosas y requieren modificaciones en los materiales plásticos utilizados para fabricar las puntas de pipeta. Este trabajo propone una técnica simple de modificación de la superficie para inducir repelencia a líquidos/proteínas en las paredes internas y externas de las puntas de las pipetas. Las puntas con infusión de lubricante propuestas con propiedades omnifóbicas pueden repeler líquidos de tensión superficial alta y baja y reducir los residuos de muestra en las puntas. Observamos una cantidad significativamente menor de tinte, coágulos de sangre y bacterias adheridas a la superficie interna de las puntas con infusión de lubricante en comparación con las puntas no tratadas. Por lo tanto, esta técnica se puede utilizar para minimizar la contaminación cruzada y aumentar la eficiencia al disminuir la pérdida de muestra debido a la adherencia por arrastre.

Los conjuntos de datos generados y analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Este trabajo fue apoyado por la NSERC Discovery Grant, el Ontario Early Researcher Award y los fondos McMaster Start-up para TFD. TFD es la Cátedra de Investigación de Nivel II de Canadá. La microscopía electrónica se llevó a cabo en el Centro Canadiense de Microscopía Electrónica (CCEM), una instalación nacional respaldada por el NSERC y McMaster. Todos los esquemas fueron creados con BioRender.com.

Departamento de Ingeniería Mecánica, Universidad McMaster, 1280 Main Street West, Hamilton, ON, L8S 4L7, Canadá

En medio de Shakeri, Hanie Yousefi, Samer Kullab, Dalya Al-Mfarej y Tohid F. Didar

Leslie Dan Facultad de Farmacia, Universidad de Toronto, 144 College Street, Toronto, ON, M5S 3M2, Canadá

Hanie Yousefi

Escuela de Ingeniería Biomédica, Universidad McMaster, 1280 Main Street West, Hamilton, ON, L8S 3L8, Canadá

Noor Abu Jarad y Tohid F. Didar

Departamento de Microbiología y Plataforma de Biomarcadores Innovadores, GH Université Paris Saclay, Hôpital Raymond Poincaré (APHP), Garches, Francia

Martín Rottman

Laboratorio de Infección e Inflamación U1173, Facultad de Medicina Simone Veil Versailles Universidad Saint-Quentin-en-Yvelines, Montigny le Bx, Francia

Martín Rottman

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AS y HY contribuyeron igualmente a este trabajo. TFD supervisó la investigación. AS y HY realizaron los experimentos, la validación de datos, la visualización y el análisis de datos, y escribieron el manuscrito con la ayuda de SK y DAM, y con aportes de MR y TD. Todos los autores leyeron y aprobaron la versión final del artículo.

Correspondencia a Amid Shakeri o Tohid F. Didar.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Shakeri, A., Yousefi, H., Jarad, NA et al. Manejo libre de contaminación y arrastre de fluidos complejos utilizando puntas de pipeta con infusión de lubricante. Representante científico 12, 14486 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-18756-x

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Recibido: 13 de mayo de 2022

Aceptado: 18 de agosto de 2022

Publicado: 25 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18756-x

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