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Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 184 (2023) Citar este artículo

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Los microfluidos de gotas ofrecen una plataforma desde la cual se han propuesto nuevas tecnologías de análisis molecular digital, detección de enfermedades, curación de heridas y síntesis de materiales. Sin embargo, las tecnologías comerciales actuales de generación de gotas, ensamblaje e imágenes son demasiado costosas y rígidas para permitir un ajuste rápido y de amplio alcance de las características/cargas de las gotas. Este cuello de botella en la creación rápida de prototipos ha limitado una mayor expansión de su aplicación. En este documento, se presenta un kit de microfluidos de gotitas de pipeta hecho en casa y económico. Este kit incluye puntas de pipeta elípticas que se pueden fabricar con una sencilla herramienta de bricolaje (hágalo usted mismo), un exclusivo chip de imágenes de centro poco profundo basado en cinta o impreso en 3D que permite un rápido montaje/inmovilización de gotas monocapa y obtención de imágenes con un sistema inteligente. cámara de teléfono o microscopio en miniatura. Las gotas se generan mediante pipeteo manual o automático sin costosas bombas de microfluidos de laboratorio. El tamaño de las gotas y la viscosidad/tensión superficial del fluido se pueden variar significativamente debido a nuestros diseños particulares de generación, ensamblaje e imágenes de gotas. La versatilidad de este kit de creación rápida de prototipos se demuestra con tres aplicaciones representativas que pueden beneficiarse de una plataforma de microfluidos de gotitas: (1) Gotas como microrreactores para reacción de PCR con transcripción inversa para detectar y cuantificar los ARN diana. (2) Las gotitas como microcompartimentos para el cultivo de espirulina y los cambios ópticos de color/turbidez en las gotitas con espirulina confirman el cultivo fotosintético exitoso. (3) Gotas como plantillas/moldes para la síntesis controlada de microgeles Janus compuestos de poliacrilamida/oro cubiertos de oro. Por lo tanto, este kit portátil fácil de fabricar y fácil de usar es ideal para laboratorios de diseño, capacitación y educación.

Los microfluidos en gotas se han convertido en una herramienta poderosa para una variedad de aplicaciones multidisciplinarias1,2. Las interesantes tecnologías biotecnológicas comercializadas y propuestas basadas en microfluidos de gotitas incluyen el ensayo unicelular3,4, la PCR digital en gotitas5,6, la detección rápida del cáncer7,8, la detección de fármacos o inmunoterapia9,10, la detección de susceptibilidad a los antibióticos11, los aloinjertos de islotes implantables12,13, etc. Para esas y muchas otras aplicaciones, las gotas se utilizan normalmente como microrreactores, microcompartimentos o plantillas/moldes y un gran número de ellas garantizan las ventajas únicas de los microfluidos de gotas14,15,16,17. Un buen ejemplo es la reacción en cadena de la polimerasa digital con gotas (ddPCR), que utiliza gotas como microrreactores6,18. Simplemente dividiendo la mezcla de reacción de PCR en muchas gotitas uniformes, los ácidos nucleicos diana se distribuyen en las gotitas de acuerdo con la distribución de Poisson y posteriormente pueden cuantificarse hasta una resolución de copia única después de la amplificación por PCR19. El rendimiento mejorado se ve reforzado por una gran cantidad de gotas (104–106) que mitiga las influencias de inhibidores o no objetivos y permite una cuantificación absoluta sin la tediosa construcción de curvas estándar20,21. Otro ejemplo es la encapsulación de células/microorganismos en gotitas o microgeles derivados de gotitas que podrían proporcionar numerosos microcompartimentos con los microambientes biofísicos/bioquímicos adecuados para un estudio de alto rendimiento de células individuales y microorganismos aislados para acelerar la detección y optimización a gran escala, incluso si se permite el análisis de ensayos secuenciales. por microgeles permeables13,22,23,24,25,26,27,28. Además de las aplicaciones de microrreactores y microcompartimentos, se han sugerido gotas como microplantillas/moldes para la síntesis de micro/nanomateriales blandos y duros29,30,31. El tamaño miniatura controlado, la gran superficie por unidad de volumen, el confinamiento y la gran cantidad de gotas permiten una fácil síntesis de materiales con las estructuras y funcionalidades deseadas debido a los rápidos efectos de segregación y concentración introducidos por un alto gradiente de hidrofobicidad, una fuerte interacción tensioactivo/superficie y apiñamiento. efectos32,33. Los microfluidos en gotas claramente han inspirado varias tecnologías prometedoras en numerosas disciplinas.

Sin embargo, los sistemas actuales de generación de gotas1,14,34, que a menudo requieren chips/dispositivos sofisticados y/o fuentes de presión de precisión (que cuestan más de cinco mil dólares para los kits comerciales de generación de gotas de PreciGenome, Elveflow, Fluigent, etc.), no son lo suficientemente simples. , barato y accesible para permitir la creación de prototipos y la capacitación fácilmente, lo que limita la implementación amplia de tecnologías de microfluidos de gotas en campos interdisciplinarios y un mayor desarrollo de nuevas tecnologías en productos comercializables. Por ejemplo, la tecnología de generación de gotas de enfoque de flujo ampliamente utilizada necesita un ajuste fino con un control preciso de los flujos de dos fases en chips de microfluidos35 y la generación de gotas de emulsión por etapas relativamente insensible al flujo generalmente necesita chips/dispositivos cuidadosamente diseñados con terrazas36. Además de la generación uniforme de gotas, el ensamblaje de gotas basado en confinamiento y los métodos de obtención de imágenes microscópicos existentes también deben simplificarse para que sean más accesibles y personalizables6,37,38. Por lo tanto, un kit de herramientas de creación de prototipos simple y rápido que incluya una tecnología de generación de gotas de microfluidos sintonizable, además de un ensamblaje de gotas robusto y módulos de imágenes que sean insensibles al tamaño de las gotas y a las propiedades viscoelásticas, permitiría una mayor expansión de sus aplicaciones en campos interdisciplinarios, muy similar a lo que ocurre con el 3D. la impresión ha hecho para biochips y otras ramas de la microfluídica39. Con este fin, basado en nuestra tecnología de gotas de pipeta desarrollada previamente40, en este trabajo se propone un kit de capacitación y creación rápida de prototipos de microfluidos de gotas de pipeta integral y estandarizado para permitir no solo características de gotas fácilmente sintonizables, sino también componentes robustos y económicos que pueden ensamblar, inmovilizar y generar imágenes. gotitas de diferente tamaño y con diferentes propiedades reológicas y superficiales. (Figura 1).

Kit de microfluidos de gotas de pipeta: (1) La ilustración esquemática de la modificación controlable de la punta de la pipeta mediante un destornillador dinamométrico da como resultado puntas de pipeta comerciales deformadas con partes de la cabeza aplanadas. La modificación cambiará el orificio circular original de la punta de la pipeta por uno elíptico y la relación de aspecto del orificio elíptico está determinada por la fuerza de torsión del destornillador. (2) Generación de gotas con las puntas modificadas mediante una micropipeta universal. Las gotas uniformes se desprenderán automáticamente al dispensar la solución acuosa manualmente a través de un orificio de punta de pipeta adecuadamente deformado en aceite fluorado. (i, ii, iii) Ejemplos de aplicaciones típicas de microfluidos en gotas sobre (i) PCR digital en gotas con gotas como microrreactores, (ii) cultivo de espirulina con gotas como microcompartimentos y (iii) síntesis controlada de microgeles con gotas como plantillas/ moldes.

La versatilidad del robusto kit se debe a tres tecnologías clave que se pueden fabricar fácil y rápidamente para permitir la máxima capacidad de ajuste. Las microgotas uniformes se generan cómodamente pipeteando líquidos desde puntas de pipeta con orificios elípticos para mejorar la extracción de las gotas. Las puntas de pipeta elípticas se preparan deformando puntas de pipeta de orificio redondo comerciales con un destornillador dinamométrico de bricolaje y el tamaño de las gotas se puede ajustar simplemente cambiando la relación de aspecto del orificio de la punta de pipeta deformada. Las gotas se empaquetan e inmovilizan contra el centro poco profundo de un chip de cinta de doble cara fácil de fabricar mediante un robusto mecanismo de ensamblaje de gotas basado en un flujo de humectación impulsado por presión capilar. La suspensión de gotas se acerca a una geometría axisimétrica estable con un menisco circular y confina las gotas a una monocapa circular concéntrica en el centro. La obtención de imágenes de gotas se simplifica debido a las microgotas grandes e inmovilizadas (de 300 a 500 micrones de diámetro) generadas por este kit, de modo que las cámaras de los teléfonos inteligentes pueden tomar imágenes de las gotas u observarlas visualmente. En términos de costo, la herramienta de modificación de puntas basada en un destornillador de bricolaje cuesta menos de cien dólares, la punta de carga de gel cuesta menos de diez centavos por punta, una micropipeta cuesta doscientos o trescientos dólares, el chip de imágenes hecho de vidrio diapositiva y varios trozos de cinta adhesiva de doble cara es menos de una cuarta parte, y las imágenes se pueden tomar con un teléfono inteligente normal de cien dólares (se necesita un transiluminador de mil dólares o un microscopio fluorescente portátil para obtener imágenes de fluorescencia). El kit completo para la generación, manipulación e imágenes de gotas (incluidas las imágenes de fluorescencia) se puede realizar con dos mil dólares, lo cual es muy rentable en comparación con los kits comerciales que cuestan más de cinco mil dólares solo para la parte de generación de gotas. Además, la micropipeta, las puntas de pipeta, los portaobjetos de vidrio y las cintas de poliimida Kapton de doble cara son consumibles de laboratorio comunes y destornilladores dinamométricos, y las cámaras de los teléfonos inteligentes son herramientas comunes, lo que significa que el kit de microfluidos con gotitas de pipeta que se propone aquí es extremadamente accesible. La versatilidad del kit se demuestra con tres aplicaciones de creación de prototipos de microfluidos de gotitas: (i) gotitas como microrreactores para PCR digital de gotitas para detectar y cuantificar los ARN diana; (ii) gotitas como microcompartimentos para el cultivo fotosintético de espirulina; (iii) gotitas como plantillas/moldes para la síntesis controlada de microgeles compuestos de poliacrilamida/oro cubiertos de oro. Estos ejemplos típicos demuestran la versatilidad y facilidad de uso del kit de microfluidos con gotitas y pipeta para la creación rápida de prototipos y la validación de aplicaciones de microfluidos con gotitas.

Para estandarizar la modificación de las puntas, se han utilizado una serie de fuerzas de torsión (ajustadas directamente y configuradas en un destornillador dinamométrico) para producir ciertas presiones para deformar puntas de pipeta con diferentes orificios elípticos (Fig. 2, "Métodos": "Punta de pipeta elíptica preparación” para obtener más detalles sobre cómo construir y utilizar la herramienta personalizada para la fabricación de puntas). La relación entre las relaciones de aspecto de los orificios de las puntas y las fuerzas de torsión aplicadas se muestran en la Fig. 3a. Una curva de calibración como esta podría proporcionar una guía para fabricar puntas de pipeta elípticas con las proporciones de aspecto de orificio deseadas para un tipo específico de puntas preparadas en las mismas condiciones. La herramienta casera proporciona un canal para ubicar las puntas y las barreras de intervalo en la pared del canal ayudan a determinar la longitud del cabezal de la punta que se está deformando para que las condiciones de fabricación de la punta elíptica sean más reproducibles. (Fig. 2a) Además, el ajuste de la longitud deformada (la longitud de la parte del cabezal de la punta se deforma como se indica en la Fig. 2b a la derecha) también permite otra forma de ajustar el grado de deformación de la punta (Fig. S1).

Modificación estandarizada de la punta de pipeta para preparar puntas con cabeza aplanada. (a) La sencilla herramienta de deformación de puntas se ensambla fácilmente con una carcasa impresa en 3D, dos portaobjetos de vidrio/metal, una abrazadera de acero y un destornillador dinamométrico. Durante el uso, se inserta una punta de pipeta entre o debajo de los dos portaobjetos de vidrio/metal. Los portaobjetos de vidrio/metal no pueden girar libremente una vez ensamblados con la carcasa impresa en 3D y transferirán la fuerza de torsión a presión para deformar la parte del cabezal de la punta de pipeta comercial. (b) Al ajustar el torque en el destornillador dinamométrico de cero a veinte, se preparan puntas de pipeta modificadas (longitud deformada: ~ 3,5 mm) con diversos grados de deformación de las partes de la cabeza.

Modificación controlada de la punta de la pipeta cambiando las fuerzas de torsión con una longitud deformada constante (~ 3,5 mm) y la correspondiente generación de gotas de pipeta: (a) relaciones de aspecto de la sección transversal de las puntas de pipeta frente al torque aplicado para la deformación de la punta, las longitudes de las puntas deformadas son de ~ 3,5 mm, insertadas las imágenes son secciones transversales típicas de orificios de punta deformados; (b) radios promedio de gotas de agua generadas con puntas de pipeta deformadas por torque, cada punto representa el radio promedio y la desviación estándar (barra de error) de las gotas generadas por la punta deformada correspondiente y las imágenes insertadas son gotas generadas por las puntas con sección transversal de orificio imágenes insertadas en (a). Basándose en las curvas, se pueden preparar puntas y gotas específicas aplicando las fuerzas de torsión correspondientes.

Las puntas deformadas con diferentes longitudes deformadas y/o diferentes fuerzas de torsión se caracterizan comprobando los orificios de la punta (Figs. 2b, 3a, S1a,b, S2a,b). Bajo la misma fuerza de torsión, cuanto más corto esté el cabezal de la punta para compartir la presión, más deformado estará el cabezal de la punta (Fig. S1b). Del mismo modo, con la misma longitud deformada, cuanto mayor sea la fuerza de torsión aplicada, más deformada estará la cabeza de la punta (Fig. 3a, S2b). Además, las puntas con diferentes propiedades mecánicas (debido a diferentes materiales de punta, dimensiones del orificio y espesor de pared, etc.) se comportarán y deformarán de manera diferente bajo la presión inducida por la misma fuerza de torsión (Fig. S3a). Como resultado de esto, para un nuevo tipo de puntas, se debe obtener una nueva curva de calibración correspondiente mediante un protocolo estándar.

Las puntas de pipeta deformadas están equipadas con una pipeta normal de 20 µL para la generación de gotas. Técnicamente, en el modo de goteo se generan gotas uniformes a caudales muy bajos14. Pero con las puntas de pipeta elípticas deformadas, se produce una extracción automática de las gotas incluso con un caudal alto debido al drenaje de agua del cuello de compresión debido a la presión elevada del agua en el cuello. Esta presión elevada se debe a la curvatura azimutal amplificada en el extremo estrecho de la sección transversal elíptica. La presión capilar del cuello mejorada da como resultado una generación más robusta y rápida de gotas uniformes más pequeñas, similar a la generación de gotas de emulsión escalonada a partir de chips de microfluidos con canales de alta relación de aspecto41 y la generación de gotas es insensible a cambios moderados en el caudal, lo que facilita el pipeteo manual para generar gotas uniformes. gotas. (Video S1) Como se demuestra en las figuras (Figs. 3b, 4, S1c, S2c, S3b, S4), cuanto mayor es la relación de aspecto del orificio de la punta de la pipeta, más pequeñas y uniformes son las gotas generadas. A partir de una relación de aspecto de ~ 3,25, el coeficiente de variación (CV) de las gotas generadas llega a ser inferior al 5 % y a partir de una relación de aspecto de ~ 4, el CV de las gotas generadas llega a ser inferior al 2 %. La uniformidad de las gotas es comparable a la de los sistemas comerciales de generación de gotas, como el paquete de generación de gotas Elveflow, que afirma tener un CV de gotas < 3%42. Las grandes faltas de uniformidad de las gotas generadas con puntas con una relación de aspecto de orificio baja se deben a dos razones. En primer lugar, las gotitas correspondientes generadas son más grandes y las gotitas más grandes son fáciles de dividir en gotitas satélite más pequeñas durante la generación y manipulación de las gotitas. En segundo lugar, la generación de gotas con puntas menos elípticas requiere caudales más bajos y es más sensible a las perturbaciones durante el pipeteo. El rango de gotas en la Fig. 4 se puede ampliar aún más utilizando puntas de pipeta de diferentes tamaños de orificios (Fig. S5).

Gotas de agua generadas por una serie de puntas de pipeta deformadas (puntas de 200 µL predeterminadas utilizadas en este trabajo) con varias relaciones de aspecto del orificio de la punta. Generalmente, para un determinado tipo de puntas, cuanto mayor sea la relación de aspecto del orificio de la punta, más uniformes serán las gotas generadas.

Una vez que se generan las gotas uniformes, otro desafío de creación de prototipos es el ensamblaje y la obtención de imágenes de las gotas. Las gotas de agua más ligeras tienden a flotar hacia la parte superior de la fase de petróleo dispersa y no se ensamblan espontáneamente para formar monocapas para su observación. Además, el aceite humectante a menudo aleja las gotas de la posición de obtención de imágenes. Estos problemas normalmente se resuelven con un complicado diseño de chip cerrado con pilares y otras barreras para confinar y empaquetar las gotas en monocapas6,37,38. Fijar la gota en su lugar contra tales barreras requiere una contrapresión sostenida y la carga se convierte en una importante tarea de microfluidos. Además, el contacto con las barreras sólidas a menudo induce la coalescencia de las gotas y, por lo tanto, requiere un flujo de carga preciso que debe ajustarse para gotas de diferentes tamaños y viscoelasticidades.

El diseño de centro poco profundo de nuestro chip de ensamblaje permite el ensamblaje espontáneo en el centro del chip y, por lo tanto, permite la carga manual con una pipeta (Fig. 5 y Video S2). El conjunto de gotas también está fijado al centro debido al efecto de la altura del canal inclinado sobre el flujo de aceite humectante, aunque sean más pequeños que la altura central. Por lo tanto, las gotas nunca están en contacto con la pared (Fig. 5b, c y Video S2). Para minimizar la resistencia de la línea de contacto, la línea de contacto humectante evolucionará de una forma irregular a una forma axisimétrica alrededor del centro poco profundo después de cargar la suspensión de gotas/aceite. Esta extensión de la línea de contacto es impulsada por el aceite humectante que se extiende sobre el sustrato. Sin embargo, la fijación de la gota de suspensión al centro se debe a la presión capilar del menisco cóncavo en la periferia de la suspensión. El aceite humectante forma películas delgadas sobre el sustrato para producir un menisco cóncavo que mantiene una presión de aceite de menisco negativa en relación con la presión del aire circundante43,44. La magnitud de la presión capilar es inversamente proporcional a la altura del canal en el menisco. Una protuberancia radialmente hacia afuera de la suspensión dará como resultado un menisco con un radio de curvatura mayor en la punta de la protuberancia, debido a la mayor altura del canal en esa posición. Este radio de menisco más grande da como resultado una presión de aceite de menisco menos negativa y drenará el líquido lejos de la protuberancia para detener el crecimiento de la protuberancia. Por lo tanto, la suspensión de aceite se acerca a una forma radialmente simétrica en el centro: está fijada al centro poco profundo. El flujo radial durante este ajuste hacia la axisimetría empaqueta e inmoviliza las gotas hacia el centro poco profundo para formar una monocapa circular alejada de la periferia del menisco. Las gotas se mueven hacia el centro, alejándose del menisco en la periferia de la suspensión, debido a la migración inducida por el cizallamiento por la alta velocidad de cizallamiento en la línea de contacto en movimiento y la repulsión hidrofóbica mejorada por el sustrato allí43. Por lo tanto, también se fija un círculo de monocapa de gotas ensambladas en el centro poco profundo, concéntrico a la línea de contacto circular (meniscos), aunque las gotas son más pequeñas que la altura del espacio en el centro. La línea de contacto fijada y la monocapa de gotas permanecen estables cuando la punta se inclina repetidamente, lo que permite el transporte a la instalación de imágenes. La altura de la cámara del marco de cinta de seis capas se selecciona para ensamblar e inmovilizar una única monocapa de gotitas generadas por pipeta, lo que simplifica la obtención de imágenes y el análisis de las gotitas. Las dimensiones del chip se pueden cambiar para acomodar gotas de diferentes tamaños y cantidades. Siempre que el aceite moje el chip que tiene una cámara con un centro poco profundo, las gotas quedarán fijadas en el centro poco profundo de la cámara del chip para simplificar la obtención de imágenes y el manejo de las gotas. Además, se podría cortar una muesca en una esquina del marco de la cinta para poder insertar puntas de pipeta en el centro de la cámara de chips para cargar las gotas sin levantar la película de cobertura (Fig. S6). En términos de descarga de gotas del chip, es simplemente un proceso inverso de carga de gotas (Video S3).

Conjunto de gotas y chip de imágenes hecho de cinta de doble cara sobre un portaobjetos de vidrio: (a) esquema del chip con una punta en la esquina que muestra cómo se cargan las gotas; (b) cargar gotas en el chip desde una esquina levantando la película de cubierta; (c) gotitas monocapa cargadas inmovilizadas en el centro poco profundo del chip para su posterior manipulación e imágenes.

El chip de centro poco profundo también se puede fabricar mediante impresión 3D con una resina transparente que se humedece con aceite (Fig. 6). El chip está diseñado para tener una altura inclinada desde la pared hacia el centro, que también tiene una altura de canal de aproximadamente 600 micrones como para el chip basado en cinta. Como era de esperar, las gotas ensambladas permanecen inmovilizadas en el centro durante el manejo y la obtención de imágenes (Fig. 6c). Un problema con este chip impreso en resina 3D es que bloquea la fluorescencia verde, posiblemente debido a los residuos del iniciador. Este problema se puede resolver si se aplica moldeo por inyección para fabricar el chip a partir de polímeros fundidos.

Un conjunto de gotas impreso en 3D y un chip de imágenes con un conector compatible: (a) el modelo 3D del chip y la sección transversal para mostrar el diseño del centro poco profundo; (b) un chip impreso; (c) gotitas monocapa inmovilizadas dentro del chip para su posterior manipulación e imágenes. Las gotas permanecerán alejadas de las paredes dentro del chip debido a la altura inclinada de la cámara interior hacia el centro. La dimensión exterior del chip de imágenes de gotas es 20 mm × 20 mm × 2,5 mm.

Con una cantidad suficiente de microgotas de nanolitros, es posible la detección y cuantificación de ácidos nucleicos individuales mediante ddPCR. Como ejemplo general, el reactivo de PCR GAPDH humano se utiliza para detectar y cuantificar el ARN humano. En este caso, se elige ARN en lugar de ADN como objetivo para que también se realice la transcripción inversa. El kit de reactivos de PCR GAPDH humano se aplica ampliamente en laboratorios de bioingeniería/biología como control endógeno básico para la normalización de otras muestras de ácidos nucleicos en pruebas cuantitativas de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real45,46. Por lo tanto, el económico kit de reactivos de PCR GAPDH y los ARN de control humano son ideales para fines de capacitación. Las gotas con la mezcla de reacción de PCR flocularán en la parte superior del aceite fluorado más denso en los tubos de PCR normales y tenderán a fusionarse durante el ciclo térmico. El problema se puede resolver añadiendo aproximadamente 1% p/v de F127 a la fase acuosa como cotensioactivo.

Para la obtención de imágenes de fluorescencia de gotitas después de ddPCR, se sugieren dos enfoques para este kit. La primera es aprovechar la cámara de un teléfono inteligente común y el transiluminador que se usa frecuentemente en los laboratorios para visualizar geles de electroforesis. Debido a que las gotas generadas al pipetear suelen tener un tamaño de varios cientos de micrones, son lo suficientemente grandes como para ser observadas visualmente y captadas por las cámaras de los teléfonos inteligentes. Con iluminación de luz azul y filtro ámbar filtrado del transiluminador, se puede registrar la fluorescencia verde (tinte FAM) de las gotas (Fig. 7b). Si la combinación de teléfono inteligente y transiluminador no es práctica, un segundo enfoque es utilizar un mini microscopio de fluorescencia portátil y económico (Fig. 7d). Ambos métodos se probaron después de la reacción de PCR y las gotitas positivas (gotas con objetivos como lo indica la fuerte fluorescencia verde amplificada) son claramente observables en ambos casos (Fig. 7). Aunque la imagen de fluorescencia de las gotas tomada con el mini microscopio portátil tiene mejor contraste (Fig. 7d) que la tomada con la cámara del teléfono inteligente (Fig. 7b), el número de gotas positivas discernibles es el mismo para las imágenes de los dos enfoques. Por lo tanto, existen soluciones confiables y accesibles para obtener imágenes de la fluorescencia de las gotitas después de la reacción de ddPCR.

Imágenes de gotas de ddPCR mediante un teléfono inteligente junto con un transiluminador sin (a) o con (b) iluminación/filtrado de fluorescencia y mediante un mini microscopio de mano sin (c) o con (d) iluminación/filtrado de fluorescencia después de 40 ciclos térmicos. Las gotas se generan mediante una punta de pipeta deformada por una fuerza de torsión de 20 libras-pulgada. Ambos métodos son adecuados para obtener imágenes de las gotas correctamente.

La eficaz obtención de imágenes de fluorescencia de gotitas conduce a la cuantificación de los ácidos nucleicos diana. Para fines de capacitación y creación de prototipos, la cuantificación se realiza mejor contando las gotas positivas, sin conocer el número total de gotas ni invocar las estadísticas de Poisson. Con números de copias bajos, cuando las gotas superan significativamente a los objetivos, el número total de gotas positivas es aproximadamente igual al número total de objetivos. La cuantificación positiva de gotas requiere una pérdida de muestra insignificante durante la generación de gotas y la obtención de imágenes. Las gotitas de nanolitros pipeteadas cumplen todos los requisitos para la cuantificación basada en el recuento de muestras de baja concentración objetivo. Se realizan experimentos repetidos para varias muestras de concentración objetivo baja (0–1 picogramo en 20 µL de mezcla de reacción) y los resultados de la cuantificación basados ​​en el recuento positivo de gotas se muestran en la Tabla 1 y en la Fig. 8. La relación lineal indica que el método es suficiente para una cuantificación aproximada y una detección precisa de muestras de baja concentración objetivo (Fig. 8). Aunque las desviaciones estándar aumentan a medida que aumentan las concentraciones objetivo, el coeficiente de variaciones pronto se estabiliza en el rango del 20 al 30 % (Tabla 1) y las variaciones probablemente sean causadas por la fluctuación de la concentración objetivo en la solución de muestra de baja concentración, la variación del volumen del micropipeta y afinidad de la molécula objetivo por las superficies del tubo de PCR y la punta de la pipeta. Además, el límite de detección calculado47 basado en el promedio de falsos positivos, la desviación estándar de las muestras en blanco y la desviación estándar de las muestras con la concentración más baja no negativa de la Tabla 1 (LoD = 0,2 + 1,645*0,45 + 1,645*1,82 = 3,92) es 3,92 copia por 20 µL de mezcla de reacción, que es comparable a los productos comerciales de ddPCR e indica que la pipeta ddPCR es buena para una detección precisa a pesar de que la cuantificación basada en el recuento se parece más a una estimación aproximada debido a las variaciones del 20 al 30 %. (Tabla 1) Aunque en esta demostración se utiliza ARN humano, esta técnica puede aplicarse potencialmente para cuantificar los ARN del virus y reducir la tasa de detección de falsos negativos de las pruebas de PCR para los virus del SARS-CoV-2 en muestras heterogéneas48,49. En consecuencia, el kit ofrece una buena formación en PCR digital en gotas para la detección y cuantificación de ácidos nucleicos.

Cuantificación basada en el recuento positivo de gotas de muestras de baja concentración objetivo. Las barras de error son desviaciones estándar.

Las microgotas proporcionan microcompartimentos y microambientes aislados para que las células o microorganismos los habiten y esta característica se utiliza activamente para el análisis/detección de células individuales/microorganismos22,23,24,25 y también para fábricas emergentes de gotas/células50,51. Para muchas de estas aplicaciones, las gotitas ofrecen manipulación y análisis indispensables de células individuales o microorganismos. Como ejemplo, para mostrar la encapsulación de gotas con nuestro kit propuesto, se cultiva espirulina de un solo microorganismo en microgotas pequeñas y grandes dentro de chips de imágenes con cinta (Fig. 9) o tubos de PCR (Fig. S7). La espirulina es un tipo de cianobacteria comestible con una excelente eficiencia fotosintética que produce una variedad de nutrientes e ingredientes para animales y humanos. El crecimiento fotosintético de la espirulina es vigoroso porque la alta solubilidad de O2/CO2 (10–20 veces mayor que la del agua) en el aceite fluorado sustenta la proliferación de microorganismos52,53. Con el tiempo, la espirulina aumenta en número y eventualmente ocupa toda la gota (Fig. 9, S7). Después de 10 días de cultivo, la tasa de proliferación calculada (número de gotas con al menos cuatro copias de espirulina/número total de gotas con espirulina) es 96,9 ± 1,8 % en seis experimentos. El crecimiento de la espirulina en microgotas más pequeñas es relativamente más lento, probablemente debido al espacio y al suministro de nutrientes más limitados. (Fig. 9a – d, i, j) El confinamiento de las gotitas es efectivo y no se observa que la espirulina se difunda o se transfiera a otras gotitas (Fig. 9c, g, j, l). Además, el confinamiento de las gotas aísla y protege la espirulina mediante las paredes virtud/blandas (interfaces gota/aceite) formadas con tensioactivos biocompatibles54. Aunque las gotas pueden encogerse después de días de crecimiento fotosintético debido a la evaporación del agua, la pipeta generó microgotas grandes todavía son lo suficientemente grandes para obtener imágenes con teléfonos inteligentes y el crecimiento continuo significa que los microorganismos de espirulina están vivos durante más de 10 días (Fig. 9e-h, S7). Las diferencias de color o turbidez causadas por la espirulina proliferada en gotitas positivas confirman el cultivo exitoso e implican la cuantificación digital de muestras de microorganismos de baja concentración después de un cultivo adecuado, como las reportadas para la cuantificación digital de gotitas de bacterias55.

Cultivo fotosintético de espirulina en microgotas pequeñas (a – d) y grandes (e – h) dentro de chips de imágenes basados ​​en cinta: (a, e) espirulina en gotitas generadas; (b, f) espirulina proliferó en gotitas positivas después de 5 días de cultivo; (c, g) espirulina proliferada en gotitas positivas después de 10 días de cultivo; (d,h) imágenes de teléfonos inteligentes de las gotitas de cultivo de 10 días que muestran diferencias reconocibles de color/turbidez de las gotitas positivas con espirulina, especialmente en microgotitas grandes; (i – l) imágenes de bajo aumento correspondientes a (a, c, e, g) respectivamente.

Intuitivamente, las gotas son excelentes plantillas/moldes para la síntesis de microgeles. Con el inicio de la reticulación, las gotas de líquido con precursores de polimerización de acrilamida se convierten en microgeles uniformes (Fig. 10a-d). La transformación de líquido a gel en gotas se utiliza además para sintetizar microgeles compuestos de poliacrilamida/oro con tapas de oro (Fig. 10e-h). La idea es explotar las diferentes escalas de tiempo cinéticas de las reacciones de gelificación/precipitación y las diferentes propiedades físicas de sus productos para modelar los materiales sintetizados. Generalmente, la red de gel tiene un efecto de confinamiento en la reacción de síntesis interior que no solo previene la sedimentación de precipitados sino que también introduce adsorción/reacción superficial para producir materiales con estructuras/morfologías distintas. Por ejemplo, se han utilizado diferentes estructuras cristalinas en redes líquidas y de gel a granel para sintetizar monocristales modelados mediante la incorporación programable de materiales extraños56. En este caso, el precursor de gelificación de acrilamida se mezcla con citrato de sodio 100 mM y cloruro de oro (III) 50 mM y esta solución será estable durante aproximadamente 6 minutos antes de que se produzca una reducción notable del oro. El período de tiempo de 6 minutos es suficiente para la generación de gotas de pipeta de la mezcla de 20 µL, que normalmente tarda unos 3 minutos en completarse. La reducción de oro en las gotitas de fase líquida generadas es rápida y una buena cantidad de oro reducido precipita en el fondo de cada gotita aproximadamente 10 minutos después de la generación de las gotitas (Fig. 10e, f). Con exposición a los rayos UV durante 2 minutos, las gotas de líquido se polimerizan y se reticulan en microgeles, mientras atrapan el oro precipitado anteriormente en el hemisferio inferior para formar tapas de oro en los microgeles (Fig. 10g, h). Después de las perturbaciones (rotación y movimiento) causadas por manipulaciones posteriores para obtener imágenes, las tapas de oro se orientan aleatoriamente (Fig. 10h), lo que indica la formación de microgeles porque, de lo contrario, todos los espacios de oro precipitarán al fondo como en el líquido de pre-reticulación. gotitas (Fig. 10f). Además, tal vez debido al confinamiento y a los efectos reductores del oro de la formación de la red de poliacrilamida in situ57, el oro recién reducido se fusiona inmediatamente en nanopartículas de oro en los nanoporos de la red de gel del microgel tras la gelificación, como lo indica el clásico color rojo vino del los microgeles (Fig. 10g). Este ejemplo de síntesis controlada de microgeles compuestos de poliacrilamida/oro cubiertos indica que las gotitas son moldes y plantillas prometedores para la síntesis de microgeles o partículas con patrones funcionales con estructuras y composiciones deseadas33,58.

Síntesis controlada de microgeles: (a – d) Imágenes de teléfono inteligente (a, c) y microscopio (b, d) de dos tamaños de microgeles de poliacrilamida preparados a partir de mezclas de 20 µL con diferentes puntas de pipeta. ( e, f ) Gotitas con precursores de gelificación y fuentes de reducción de oro antes de la gelificación. En las gotitas en fase líquida, el oro reducido precipitará en el fondo de las gotitas debido a su mayor densidad. Las gotitas se reticulan con luz ultravioleta para sintetizar los microgeles compuestos de poliacrilamida/oro cubiertos en (g,h). El proceso de gelificación UV también acelerará la reducción del oro y la red de poliacrilamida formada in situ confina el crecimiento del oro reducido para producir (g) microgeles de color rojo vino llenos de nanopartículas de oro. El oro previamente precipitado en el fondo de cada gota de líquido se fijará en su lugar para eventualmente preparar microgeles (h) con tapas de oro. Las imágenes de (a,c,e,g) se toman con un teléfono inteligente, mientras que las imágenes de (b,d,f,h) se toman con un microscopio de mesa.

En resumen, este trabajo ha proporcionado un kit casero de creación rápida de prototipos para microfluidos de gotitas que pueden utilizar investigadores principiantes y no expertos de diversos orígenes. El desafiante y complicado flujo de trabajo de microfluidos de gotas de generación/ensamblaje/imagen de gotas, que a menudo requiere equipos comerciales costosos que son difíciles de ajustar, se simplifica mediante la generación de gotas de pipeta con puntas de pipeta elípticas fáciles de fabricar, ensamblaje de gotas e inmovilización en el chip de centro poco profundo ( fabricados con cintas o impresión 3D) e imágenes de gotas mediante un teléfono inteligente o un mini microscopio portátil. Estos diseños permiten la generación fácil de gotas uniformes con diferentes tamaños y con un fluido disperso de viscosidad, tensión superficial y contenido celular arbitrarios. Se eligen y realizan tres ejemplos para demostrar las aplicaciones versátiles de esta plataforma de microfluidos de gotitas en moléculas individuales, microorganismos individuales y síntesis de materiales con gotitas utilizadas como microrreactores, microcompartimentos y plantillas/moldes, respectivamente: (i) reacción de PCR digital de gotitas en gotitas para cuantificar ARN de baja copia en el punto de necesidad sin comprar instrumentos costosos; (ii) cultivo fotosintético de espirulina en gotitas; (iii) síntesis controlada de microgeles compuestos de poliacrilamida/oro cubiertos. Aunque los tres ejemplos no se analizan en profundidad, hemos demostrado que el kit se puede utilizar para respaldar la creación de prototipos y pruebas rápidas y extensas. Por lo tanto, el kit de gotitas de pipeta debería facilitar el diseño, la creación de prototipos y la capacitación del personal de tecnologías de microfluidos de gotitas por parte de usuarios no expertos.

Para estandarizar el proceso de modificación de la punta, se ensambla una herramienta basada en un destornillador dinamométrico. Básicamente, la herramienta transfiere las fuerzas de torsión en presiones para deformar las puntas de las pipetas. Se combina una abrazadera de metal con una carcasa impresa en 3D que evitará la rotación de los portaobjetos de vidrio/metal y el movimiento de las puntas de las pipetas mientras se deforman. Se proporciona un archivo de modelo del caso impreso en 3D en Información de respaldo.

Para la preparación de una punta de pipeta elíptica, la parte de la cabeza de una punta de orificio redondo normal (puntas de carga de gel Fisherbrand™, 1–200 μl, puntas predeterminadas utilizadas en este trabajo si no se especifica otra) se inserta entre o debajo de los dos vasos. /diapositivas metálicas montadas en la herramienta de modificación de puntas. El canal en la caja impresa en 3D ayuda a ubicar las puntas y las barreras de intervalo en las paredes del canal ayudan a determinar cuánto tiempo se inserta la punta para su deformación, de modo que las puntas se deformen de una manera más controlable y reproducible. Se establece directamente una determinada fuerza de torsión en el destornillador dinamométrico y el destornillador se utiliza para atornillar el tornillo en la abrazadera de metal hasta alcanzar el par deseado. Después de diez segundos, se libera el torque y se retira la punta deformada. Mientras el destornillador comprime la punta, los portaobjetos de vidrio/metal no pueden girar libremente en la carcasa impresa en 3D y, por lo tanto, transforman el torque en presión para deformar la parte del cabezal de la punta de la pipeta a la sección transversal elíptica deseada. Las diapositivas de vidrio rígido se romperán cuando la fuerza de torsión sea superior a 20 pulgadas-libra, y se pueden usar placas/deslizamientos de metal u otro material más resistentes para deformar las puntas bajo fuerzas de torsión de deformación más altas.

Para medir las proporciones de los orificios de las puntas, se cortan trozos de ~ 2 mm de largo del orificio de las puntas compradas o deformadas con hojas de afeitar nuevas y los trozos cortados se adhieren verticalmente a una cinta Kapton de poliimida de doble cara con un lado de la cinta ya unido a un portaobjetos de vidrio normal. Para facilitar la obtención de imágenes, las superficies de los orificios de la punta original están en contacto con la superficie de la cinta. Luego, se obtienen imágenes de los orificios de las puntas en el portaobjetos de vidrio con un microscopio (Olympus IX71) y los dos ejes (largo y corto) de los orificios se miden mediante dos segmentos de línea de coordinación ortogonales en Adobe Illustrator (Fig. S8). Brevemente, para una imagen de orificio de punta, se dibuja una línea para indicar el eje largo y luego la línea se copia en su lugar y se gira 90°. La línea copiada y rotada se ajusta a la longitud del eje corto del orificio (solo se cambia la longitud, no hay rotación ni desplazamiento de la línea para que las líneas de los ejes largo y corto sean perpendiculares entre sí y se crucen en el punto medio del eje largo). Finalmente, las longitudes de las dos líneas se registran y se utilizan para calcular la relación de aspecto, es decir (longitud del eje largo)/(longitud del eje corto).

La punta de la pipeta con cabeza aplanada está conectada a una micropipeta normal de 20 µL. Luego, se aspiran ~ 10 µL de aceite fluorado (HFE 7500 con 2 % en peso de tensioactivo RAN-008, RAN Biotechnologies) en la punta de la pipeta y posteriormente se pipetean fuera de la punta a un tubo de PCR de 200 µL (Cole-Parmer, artículo # EW -67103-90) precargado con 40–50 µL de aceite fluorado. La punta de la pipeta se seca al aire durante unos 50 s. Luego se utiliza la micropipeta con la punta deformada para aspirar el líquido de muestra. La punta de la pipeta con el líquido de muestra se inserta en los 40–50 µl de aceite fluorado precargados en el tubo de PCR de 200 µl. Después de unos segundos, el aceite se mojará dentro y alrededor de la superficie del orificio de la punta. En algunos casos (como con muestras líquidas viscosas, puntas muy deformadas, etc.), el aceite no se moja mucho dentro del cabezal de punta, sería útil ajustar hacia atrás la micropipeta para aumentar el volumen entre 0,5 y 1 µL para introducir el aceite en el cabezal de punta. y humedezca las superficies internas de la punta. Después de humedecer el cabezal de la punta con aceite, el líquido de muestra dentro de la punta se pipetea lentamente hacia el aceite para lograr una extracción automática en gotas uniformes. El caudal de pipeteo recomendado es inferior a 10 µL/min. Dado que la generación de gotas no es sensible a pequeños cambios en el caudal, es posible pipetear manualmente para lograr la generación de gotas para puntas elípticas de alta relación de aspecto. Sin embargo, se recomienda una micropipeta eléctrica con un caudal controlado para la generación automatizada de gotas de pipeteo.

Nuestro exclusivo chip de centro poco profundo está hecho de seis capas de cinta de poliimida común de doble cara sobre un portaobjetos de vidrio y la parte superior está cubierta por un trozo de película protectora de la cinta (revestimiento de cinta) después de cortar una cámara de la cinta en capas para gotas. cargando. Al colocar la película protectora de la cinta (el lado de la película originalmente en contacto con la cinta está hacia abajo y luego se une al marco de la cinta), la película transparente en el centro del marco de la cinta se presiona sobre la superficie del portaobjetos de vidrio simplemente con el pulgar y luego el faldón de la película transparente se adhiere firmemente al marco de la cinta. Debido a que la película transparente en el centro se presiona hacia abajo durante la cobertura, aunque la película rebotará un poco después de liberar la presión, el espacio entre la película y el portaobjetos de vidrio se vuelve más estrecho en el centro del chip de cinta (Fig. S9). Se recomienda presionar la película con fuerza tanto en el centro de la superficie deslizante de vidrio como en el faldón del marco de la cinta para que el espacio central sea lo más estrecho posible, especialmente en marcos que no tienen cinta adhesiva, de modo que quede un centro poco profundo incluso después de levantar el conner. durante la carga de la muestra. Una vez que hay un centro poco profundo, no es necesario un control muy preciso de la altura del espacio estrecho. Antes de cargar las muestras, se podría usar una fase de petróleo puro para probar el chip y asegurarse de que el centro poco profundo pueda estabilizar el petróleo en el pozo central. Si la fase de aceite flota hacia las paredes del marco de la cinta, retire el aceite y repita el paso de cubrir/fijar la película o haga una nueva viruta si el marco de la cinta ya no es adhesivo. La dimensión del chip es bastante flexible y se recomienda un chip con una diapositiva de vidrio de 75 mm por 50 mm, un marco de cinta exterior de 50 mm por 50 mm e interior de 30 mm por 30 mm y una película protectora de 56 mm por 56 mm para la inicial. ensayos (Fig. 5a). Como se mencionó, la altura del espacio en el centro para un chip basado en cinta de seis capas es de aproximadamente 600 micras, lo que puede estimarse aproximadamente por los diámetros exteriores (OD) de ciertas puntas de pipeta, como la punta de 0,57 mm de diámetro exterior utilizada para la carga de gotas en este trabajo. . Puede ser necesario algún ajuste de la altura central reducida de la cámara usando menos capas de cinta para gotas más pequeñas. El chip se puede reutilizar hasta que el marco de la cinta ya no sea lo suficientemente adhesivo como para mantener una estructura de cámara central poco profunda. Se recomienda cinta súper adhesiva de doble cara para virutas más duraderas. En su lugar, se podrían usar dos capas de una costosa cámara de sellado del marco de PCR (Bio-Rad, 15 × 15 mm, 65 µL #SLF0601) para fabricar el chip de imágenes si cortar una cámara de la cinta de poliimida de seis capas es un problema.

El chip de ensamblaje de centro poco profundo también se puede imprimir en 3D en lugar de fabricarlo mediante el método de cinta adhesiva anterior. El chip está diseñado mediante un software gratuito en línea (Tinkercad) y se imprime mediante una impresora 3D de resina popular y barata (ELEGOO Mars 2 Pro) con una resina transparente (Siraya Tech Blu 3D Printer Resin Clear V2). El modelo 3D se corta mediante un software gratuito (CHITUBOX Basic) con un tiempo de exposición de 4 s, un tiempo de exposición del fondo de 40 s, una distancia de elevación de 8 mm, una altura de la capa de impresión de 50 µm, una velocidad de elevación de 80 mm/min y una velocidad de retracción de 210 mm/min. . Después de la impresión, el chip se lava con una solución de resina al 25-50 % en alcohol isopropílico (IPA). No se recomienda el lavado con IPA puro porque limpiará demasiado el chip no completamente reticulado y hará que las superficies del chip sean ásperas y menos transparentes. El chip limpio se cura con luz ultravioleta cuatro veces con una exposición de 5 minutos en una caja de curado (ELEGOO Mercury Plus 2 en 1 Estación de lavado y curado V2.0) antes de su uso.

Se utiliza una punta de pipeta con orificio redondo recién comprada (puntas de pipeta con carga de gel VWR®, 1–200 µl, punta redonda, diámetro exterior de 0,57 mm) para aspirar la suspensión de gotas/aceite del recipiente. Luego, la pipeta entrega la suspensión al centro del chip de imágenes a través de una esquina del chip de película adhesiva levantando ligeramente la película de cubierta en esa esquina (ver video en Información de respaldo). Alternativamente, se puede cortar una muesca del marco de la cinta en una esquina para insertar la punta a través de la muesca hasta el centro del chip de imágenes sin levantar la película de cubierta. Se fabrica una entrada de pipeta para el chip impreso en 3D con el mismo propósito. Es importante destacar que debido a la estructura central poco profunda (altura reducida), la suspensión no fluirá libremente a pesar del aceite humectante. En cambio, se fijará en el centro del chip de imágenes para obtener imágenes ópticas convenientes con un teléfono inteligente (OnePlus 7 Pro) o un microscopio (Olympus IX71). Las imágenes de microscopio se utilizan para el análisis de uniformidad y tamaño de las gotas para validar el rendimiento de la generación de gotas de la pipeta. Brevemente, se establece una escala en ImageJ de acuerdo con la barra de escala del microscopio y luego se miden las áreas de proyección de las gotas individuales para calcular el radio de cada gota. Debido a que la altura de la cámara del chip de imágenes es de aproximadamente 600 µm, las gotas más grandes que eso pueden aplanarse un poco cuando se cargan y ensamblan dentro del chip de imágenes, produciendo así mayores áreas de proyección y posteriormente mayores radios de lo normal.

Para obtener imágenes de fluorescencia, el chip con gotas se coloca en un transiluminador de luz azul (Clare Chemical Research) y luego se coloca un filtro ámbar encima del chip de imágenes. La fluorescencia de las gotas se visualiza con un teléfono inteligente en circunstancias de poca luz u oscuridad después de sintonizar el transiluminador. Si no hay un transiluminador disponible, se recomienda un mini microscopio de fluorescencia portátil asequible (Dino-Lite AM4115T-GFBW) para obtener imágenes de gotas.

Se prepara una mezcla de reacción típica con 5 µl de mezcla Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X (New England Biolabs, n.º de catálogo M3019S), 1 µl de cebadores y sondas de GAPDH humano (Thermo Fisher Scientific, n.º de catálogo 4333764 T), 2 µl de 10 Solución acuosa % p/v de F127, 0–10 µl de ARN de control humano diluido (Thermo Fisher Scientific, catálogo n.º 4,307,281) como objetivo y 12–2 µl de agua libre de nucleasas para obtener un volumen total de mezcla de 20 µl. Los reactivos congelados se derriten en hielo y se mezclan pipeteando antes de su uso y se devuelven al refrigerador inmediatamente después de su uso. La solución acuosa de F127 al 10 % p/v se prepara disolviendo 0,1 g de polvo de F127 (Sigma-Aldrich, BioReagent, n.º de catálogo P2443-250G) en 1 ml de agua fría libre de nucleasas (Thermo Fisher Scientific, n.º de catálogo R0582) y la La solución se almacena a 4 °C. Una vez que se completa la mezcla de reacción, se generan gotas uniformes en los tubos de PCR como se mencionó anteriormente. El tubo de PCR con las gotitas de la mezcla de reacción se coloca inmediatamente en un ciclador térmico portátil (Bio-Rad, MJ Mini Thermal Cycler) para la reacción de PCR con un protocolo de 10 min de transcripción inversa a 52 °C, 2 min de desnaturalización a 95 °C, 40 ciclos de 10 s a 95 °C y 30 s a 60 °C.

La espirulina (ACAp-01003) y el correspondiente kit completo de medios de cultivo (sales + nutrientes, MKAp-00001) son de Algae Research Supply. El medio de cultivo se prepara disolviendo las sales y nutrientes en una determinada cantidad de agua recomendada por el proveedor. Luego, la suspensión de espirulina se diluye con los medios de cultivo hasta las concentraciones deseadas. La espirulina y los medios de cultivo bien mezclados se dispersan en gotas pipeteando la generación de gotas con una punta elíptica deformada por una fuerza de torsión de 20 libras-pulgada. Después de encapsular el microorganismo, las gotitas (cargadas en chips de imágenes basados ​​en cinta de doble cara o en tubos de PCR de 200 µL, junto con el aceite de generación de gotitas) se colocan en el alféizar de una ventana a la luz del sol para el crecimiento y la proliferación de la espirulina. La esquina del chip de imágenes y la tapa del tubo de PCR se abren una vez al día durante aproximadamente 1 minuto con fines de intercambio de gases durante el cultivo de espirulina en gotas. En estas condiciones, el ciclo de vida de la espirulina es de 2 a 3 semanas.

Para la preparación de microgel de poliacrilamida, se mezclan 5 µl de solución de monómero y reticulante (acrilamida: bis-acrilamida 29:1, solución al 40 %, Fisher BioReagents, BP1408-1) con 13 µl de agua desionizada y 2 µl de solución iniciadora al 2 % p/v. . La solución de iniciador al 2% p/v se prepara disolviendo 10 mg de polvo de fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio (LAP, Sigma-Aldrich, 900,889-1G) en 500 µl de agua y el tubo que contiene la solución se envuelve con una envoltura de aluminio. papel de aluminio y se coloca en la oscuridad cuando no esté en uso. La mezcla precursora de 20 µl resultante se genera en gotas pipeteando con una punta elíptica deformada por una fuerza de torsión de 20 libras-pulgada. Además de esta punta de pipeta, otro tipo de punta (punta de microcargador Eppendorf) con un tamaño de orificio reducido también se deforma con la misma fuerza y ​​se utiliza para generar gotas con tamaños más pequeños. Las gotitas generadas se transforman en microgeles uniformes después de 2 minutos de irradiación en una caja UV (Electro-Lite, Electro-Cure 500).

Para la síntesis controlada de microgeles compuestos de poliacrilamida/oro con tapas de oro, la solución se prepara con 10 µL de agua, 5 µL de monómero y solución de reticulante (Acrilamida: Bis-Acrilamida 29:1, solución al 40 %, Fisher BioReagents, BP1408-1 ), 2 µL de solución iniciadora LAP al 2 % p/v, 2 µL de solución de citrato de sodio 1 M (Sigma-Aldrich, W302600-1 KG-K) y 1 µL de solución de cloruro de oro 1 M (Sigma-Aldrich, 520,918-1G). Después de mezclar bien, la solución se genera inmediatamente en gotas pipeteando con una punta elíptica deformada por una fuerza de torque de 20 pulgadas-libra. El oro recién reducido precipitará en el fondo de cada gota. Diez minutos más tarde, las gotas se reticulan para formar microgeles colocándolas en una caja UV durante 2 minutos. El proceso de gelificación fijará el oro precipitado en su lugar para formar tapas sobre los microgeles uniformes.

Los autores declaran que todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo y en la Información complementaria.

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Este trabajo ha sido apoyado por el Fondo Común de los NIH, a través de la Oficina de Coordinación Estratégica/Oficina del Director de los NIH, 4UH3CA241684-03. Los autores agradecen el curso de desarrollo de instrumentación impartido por el Prof. Jeffrey Kantor en la Universidad de Notre Dame.

Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular, Universidad de Notre Dame, Notre Dame, IN, 46556, EE. UU.

Liao Chen, Chenguang Zhang, Vivek Yadav, Angela Wong, Satyajyoti Senapati y Hsueh-Chia Chang

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LC inició, diseñó y dirigió el trabajo. H.-CC asesoró el trabajo. H.-CC y SS adquirieron la financiación y gestionaron el proyecto. CZ contribuyó al esfuerzo de impresión 3D y VY ayudó con el análisis de imágenes de gotas. AW ayudó a probar la PCR digital de gotas de pipeta cuando era estudiante de ingeniería. LC y H.-CC escribieron el artículo con contribuciones de todos los autores.

Correspondencia a Hsueh-Chia Chang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Chen, L., Zhang, C., Yadav, V. et al. Un kit de entrenamiento y creación rápida de prototipos y microfluidos con gotitas de pipeta hecho en casa para PCR digital, encapsulación de microorganismos/células y síntesis controlada de microgeles. Representante científico 13, 184 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-27470-1

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Recibido: 26 de mayo de 2022

Aceptado: 02 de enero de 2023

Publicado: 05 de enero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27470-1

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