Seguridad preclínica y biodistribución de CRISPR dirigido a VIS en países no

Terapia génica (2023)Citar este artículo

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En este estudio, demostramos la seguridad y utilidad de la tecnología de edición de genes CRISPR-Cas9 para la edición in vivo de ADN proviral en macacos rhesus infectados por el virus de la inmunodeficiencia simia (VIS) controlados viralmente y tratados con ART, un modelo establecido para la infección por VIH. EBT-001 es un vector basado en AAV9 que suministra SaCas9 y ARN guía dual diseñado para apuntar a múltiples regiones del genoma del SIV: las LTR virales y el gen Gag. Los resultados presentados aquí demuestran que una única inoculación intravenosa de EBT-001 en cada uno de los 3 niveles de dosis (1,4 × 1012, 1,4 × 1013 y 1,4 × 1014 copias del genoma/kg) dio como resultado una biodistribución amplia y funcional de AAV9-EBT-001 a reservorios tisulares conocidos de VIS. No se observaron efectos fuera del objetivo ni patología anormal, y los animales volvieron a su peso corporal normal después de recibir EBT-001. Es importante destacar que los macacos que recibieron las dos dosis más altas de EBT-001 mostraron mejores recuentos absolutos de linfocitos en comparación con los controles tratados con antirretrovirales. En conjunto, estos resultados demuestran seguridad, biodistribución y edición de ADN proviral in vivo después de la administración intravenosa de EBT-001, lo que respalda un mayor desarrollo de la edición de genes basada en CRISPR como un posible enfoque terapéutico para el VIH en humanos.

Los primates no humanos (PNH) se han utilizado para comprender la infección lentiviral, su patobiología, su patogénesis y para predecir la eficacia clínica desde el comienzo de la pandemia del VIH, y recientemente para evaluar estrategias de erradicación y enfoques innovadores para curar el VIH [1,2,3]. . En los estudios presentados aquí, empleamos macacos rhesus indios infectados con el virus de la inmunodeficiencia simia (VIS) y tratados con antirretrovirales (ART) para evaluar la biodistribución, la seguridad y la capacidad del tratamiento de edición de genes CRISPR/Cas9 (EBT-001) para apuntar a sistemas integrados. SIV administrado en una única infusión en bolo intravenoso (IV) [4]. EBT-001 (que codifica los ARN guía de direccionamiento de SIV) es el homólogo simio de EBT-101 (que codifica los ARN guía de direccionamiento de VIH) y está compuesto por una construcción CRISPR todo en uno encapsulada de virus adenoasociado de serotipo 9 (AAV9) que expresa simultáneamente el Endonucleasa SaCas9 y ARN guía dual (ARNg) dirigidos a las repeticiones terminales largas (LTR) virales y al gen Gag. EBT-101 está diseñado para la eliminación de grandes secuencias de ADN de SIV proviral integradas intermedias ubicadas entre los sitios objetivo de CRISPR previstos, generando así 3 posibles eliminaciones: 5'LTR a Gag, Gag a 3'LTR y 5'LTR a 3'LTR. . El uso de la administración de AAV9 está respaldado por nuestros estudios iniciales en modelos animales pequeños y grandes, además de una gran cantidad de evidencia de ensayos clínicos de terapia génica anteriores en los que AAV9 ha demostrado seguridad, eficacia y amplias propiedades de biodistribución [4,5,6]. . Aquí, presentamos datos más completos sobre seguridad, incluidos análisis extensos fuera del objetivo y biodistribución de dosis múltiples (1012, 1013, 1014 GC/kg) de EBT-001 y un estudio extendido (3 y 6 meses) en un macaco rhesus indio. Modelo SIV. Este estudio preclínico de seguridad, biodistribución y eficacia demostró que una única administración intravenosa de EBT-001 para la edición de SIV fue bien tolerada y puede alcanzar y extirpar ampliamente los reservorios virales en los NHP sin que se observen efectos fuera del objetivo. Estos resultados respaldan que se puede utilizar una única inoculación intravenosa de EBT-101 para la edición de genes del VIH para llegar a los reservorios virales en tejidos infectados en todo el cuerpo para la edición in vivo segura y específica del ADN proviral del VIH latente.

Este estudio fue aprobado por el IACUC de BIOQUAL, número de protocolo 18-036. Se obtuvieron doce monos macacos rhesus indios machos (Macaca mulatta) del Centro de Investigación de Primates del Caribe en Puerto Rico. Se realizaron dos estudios. El primero fue un n = 10 con animales aleatorizados por un estadístico en cuatro grupos de tratamiento: 3 no tratados, 3 tratados con 1,4 × 1012 GC/kg EBT-001 y 4 tratados con 1,4 × 1013 GC/kg EBT-001 (2 sometidos a necropsia). a los 3 meses y 2 a los 6 meses post EBT-001). La aleatorización se realizó utilizando un método de aleatorización de bloques permutados con la restricción de que los animales emparejados con compañeros sociales estuvieran en el mismo grupo. El segundo estudio fue con un n = 2 utilizando una dosis de EBT-001 1 log más alta de 1,4 × 1014 GC/kg y aquí no se realizó aleatorización. Todos los animales fueron examinados y resultaron triple negativos para Mamu-A*01, Mamu-B*08 y Mamu-B*17. Todos los macacos rhesus fueron recibidos en las instalaciones Piccard Drive de BIOQUAL, en Rockville, MD, donde se realizaron todos los estudios in vivo descritos aquí. Los macacos rhesus fueron sometidos a una prueba serológica previa para detectar retrovirus (STLV y SIV), virus SA8, virus SHF y virus del sarampión antes del estudio. Los animales se infectaron con SIVmac239 (un obsequio del Dr. Preston Marx, Tulane Primate Center). Los animales comenzaron con un régimen de TAR diario de tenofovir (TDF; #T018500; 15 mg/kg/animal), emtricitabina (FTC; #E525000; 50 mg/kg/animal) y dolutegravir (DTG; #D528800; 2,5 mg/ kg/animal) (Toronto Research Chemicals) comenzando el día 28 después de la infección y continuó hasta la necropsia. Se observó la morbilidad, mortalidad, lesiones y disponibilidad de alimento y agua de los animales. Todos los animales con mala salud fueron identificados para su posterior seguimiento, tratamiento clínico y posible eutanasia. Las observaciones incluyeron, entre otras, evaluación de la piel, pelaje, ojos, orejas, nariz, cavidad bucal, tórax, abdomen, genitales externos, extremidades y pies, efectos respiratorios y circulatorios, efectos autonómicos como la salivación, efectos en el sistema nervioso. incluyendo temblores, convulsiones, reactividad al manejo, efectos neurológicos/conductuales y comportamiento inusual. La carga viral del VIS (límite de detección de 50 copias/ml) se midió en plasma de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) durante el curso de la infección (material y métodos complementarios). Se recolectó sangre completa durante varios días durante el período de estudio y se envió a IDEXX BioAnalytics, Inc. para análisis de hemograma completo (CBC) y química sanguínea. A los animales se les administró EBT-001 6 meses después de la infección por VIS con una infusión intravenosa lenta a una velocidad de 1 ml/min. La cantidad de vector EBT-001 que se dosificará se añadió a un total de 100 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1X para cada animal según el peso corporal y la dosis actuales (Tabla S2). Los animales se sometieron a una necropsia completa 3 o 6 meses después de la infusión de EBT-001 (material y métodos complementarios). En BioQual no se realizó ningún cegamiento de los grupos de animales.

Esta información se puede encontrar en el material y métodos complementarios (material y métodos complementarios y figuras S1 a S4).

Se utilizó un ensayo qPCR basado en TaqMan para cuantificar el ADN de EBT-001 (vector) en tejidos (Charles River) y en sangre a lo largo del tiempo (material y métodos complementarios).

Utilizamos 2 ensayos de PCR anidados (5 G EXA y G3 EXA) para detectar los diferentes amplicones/productos de escisión en muestras de órganos internos y tejidos obtenidos de macacos tratados con el producto de terapia génica EBT-001 (SIV AAV9 CRISPR/Cas9) (material complementario y métodos). Se calculó una estimación de la edición solo para los productos 5 G (resultados complementarios, tablas S8 y S9, y figura S6). El personal de investigación estaba cegado a los grupos de animales durante los ensayos y análisis de escisión.

Las muestras de plasma con EDTA se analizaron mediante el ensayo Mesoscale Discovery (MSD). Cada pocillo de la placa es una superficie de electrodo de trabajo que absorbe el reactivo de captura. En el estudio se utilizaron el panel de citocinas 1 (NHP, MSD v-plex K15057D) y el panel proinflamatorio 1 (NHP, kit MSD n.º K15056D) y se validaron específicamente para NHP. Primero, las placas se lavaron 3 veces y se incubaron con calibradores/muestras durante 2 h con agitación. Luego las placas se lavaron y se incubaron con el cóctel de anticuerpos de detección durante 2 h. Después del último paso de lavado, se leyeron las placas y se analizaron los datos utilizando el software MSD.

Las medidas continuas se presentaron mediante diagramas de dispersión y se resumieron como media ± esfuerzo estándar de la media. Para el peso de los monos, se comparó el Grupo 1 (sin tratar) con los Grupos 2, 3 y 4 combinados (tratados). Se utilizó un modelo lineal de efectos mixtos para comparar el cambio porcentual en el peso desde antes de EBT-001 a lo largo del tiempo entre los grupos tratados y no tratados. La significación estadística se basó en un nivel alfa bilateral inferior a 0,05. La varianza fue similar entre los grupos y los datos se distribuyen normalmente.

La nominación de sitios de edición fuera del objetivo se realizó utilizando el canal patentado COTANA que se basa en una herramienta de código abierto Cas-OFFinder v2.4.1 (https://github.com/snugel/cas-offinder/), que proporciona resultados de búsqueda similares [ 7]. Los sitios cromosómicos de salida se realinearon localmente y se calificaron utilizando la herramienta nuclease-off-target v3.0.0 (https://github.com/eli88fine/nuclease-off-target) con la matriz de puntuación de los partidos de penalización que se muestra en la Tabla S1. Para el análisis WGS, se utilizó HIVE (https://hive.aws.biochemistry.gwu.edu/dna.cgi?cmd=main) [8, 9].

Se utilizaron herramientas de diseño de ARNg CRISPR para identificar ARNg que se dirigen a LTR y Gag con una probabilidad mínima de efectos no deseados para las guías dirigidas al VIH descritas anteriormente [6, 10]. Investigaciones anteriores demostraron eficacia al atacar el VIH en cultivo y utilizar un modelo de ratón humanizado infectado con ARN guía dirigidos a LTR-1 y GagD [6]. Para este trabajo en macacos rhesus, se eligieron ARNg dirigidos al VIS para representar las mismas regiones que las guías del VIH para estos estudios de biodistribución y seguridad.

La herramienta bioinformática COTANA (CRISPR Off-Target Nomination & Analysis) buscó exhaustivamente en el genoma de referencia del macaco rhesus (ensamblaje del genoma NCBI Mmul_10) las secuencias cromosómicas más similares al sitio objetivo. COTANA generó cada sitio nominado con el número especificado de diferencias entre la secuencia de ARNg y ADN (Tabla 1). El resultado de la búsqueda exhaustiva, que incluye discrepancias y posibles protuberancias, contiene pocos sitios nominados en el genoma del macaco rhesus y muy pocos con menos de 4 diferencias (materiales y métodos complementarios). La lista de sitios de salida también tiene algunos con puntuaciones de coincidencia de penalización bajas, lo que generalmente indica una mayor posibilidad de localizar sitios fuera del objetivo con secuencia verificada. Las puntuaciones de los partidos de penalización se calcularon en función del número, tipo y ubicación crecientes de los desajustes y protuberancias entre el ARNg y la secuencia cromosómica (Fig. 1). Cuando se utiliza la edición de genes para corregir mutaciones que causan enfermedades, generalmente se limita a los pocos sitios objetivo más cercanos. Cuando se seleccionan secuencias virales para su inactivación, existe mucha mayor flexibilidad, ya que se pueden escanear bioinformáticamente múltiples estrategias de focalización y series de sitios objetivo para elegir sitios objetivo virales conservados que tengan un número mucho menor y una similitud de ubicaciones cromosómicas [11,12,13]. Esos ARNg generan muchos menos sitios que los ARNg que se dirigen a secuencias codificantes, como se observa en publicaciones anteriores y al estudiar EBT-101 [11, 12].

Se enumeran todos los sitios en el resultado bioinformático de las búsquedas del genoma del macaco rhesus utilizando la guía SIV LTR que permite tres diferencias y Gag que permite cuatro diferencias. La guía (en color) y la secuencia PAM (gris) se enumeran en la parte superior, la secuencia cromosómica en la parte inferior y las ubicaciones y la identidad de las coincidencias se muestran en cuadros. También se muestran los dos tipos de protuberancias. Los espacios en el ADN cromosómico con respecto al ARN guía se muestran en cuadros rojos con guiones. Los nucleótidos adicionales en el ADN cromosómico en relación con la guía se muestran en triángulos rojos. El número de discrepancias y protuberancias y la puntuación de coincidencia para cada ubicación cromosómica se enumeran en la columna de la derecha. No se identificaron loci sin coincidencias en los 8 nucleótidos proximales donde las diferencias son menos toleradas, delineadas en rojo. Además, ninguno de los loci fuera del objetivo nominados tiene una puntuación de penalización inferior a 2 (columna derecha). Par de bases Bp, cromosoma chr, repeticiones terminales largas LTR, discrepancia MM, motivo adyacente al protoespaciador PAM, virus de inmunodeficiencia simia SIV.

En dos estudios coincidentes, se utilizaron NHP infectados con VIS y tratados con antirretrovirales como modelo animal grande para probar la capacidad del EBT-001 administrado por AAV9 para eliminar el ADN del VIS integrado. En el estudio uno, un total de 10 macacos rhesus machos (Macaca mulatta) se dividieron en 3 grupos: el grupo 1 no recibió tratamiento con EBT-001, el grupo 2 con 1,4 × 1012 copias del genoma (GC)/kg de EBT-001 y el grupo 3 con 1,4 × 1013 GC/kg de EBT-001 (Fig. 2A). En el estudio dos, se administró una dosis más alta (1,4 × 1014 GC/kg) de EBT-001 a 2 animales del Grupo 4 (Fig. 2B). Ambos estudios examinaron NHP infectados con SIVmac239 (200 TCID50) por vía intravenosa y tratados con un régimen de TAR triple (tenofovir (TDF), emtricitabina (FTC) y DTG) por vía cuadrada (Fig. 2C). Este régimen fue seleccionado por su similitud con la forma en que se trata a los humanos infectados por el VIH para controlar la infección por VIH. El TAR comenzó 28 días después de la infección y los 12 animales permanecieron en TAR durante todo el estudio. Una vez que los niveles virales se redujeron a niveles mínimos en la sangre, los animales se mantuvieron solo con ART (Grupo 1) o se trataron con una de las 3 dosis de EBT-001 administradas mediante una única infusión intravenosa (Fig. 3C, Material y métodos complementarios, Tabla S2). Todos los monos recibieron dosis completas de EBT-001. Un mono (CK49) en el Grupo 3 experimentó dificultad para respirar e hipoxia después de la administración de anestesia que empeoró después de la infusión de EBT-001. La infusión de EBT-001 se detuvo mientras el mono era tratado por edema pulmonar agudo y se recuperaba. La dosis restante de EBT-001 se administró varios días después sin complicaciones. Esta fue una reacción adversa debida al agente anestésico Dexdomitor porque la nueva exposición de EBT-001 fue bien tolerada y los síntomas coincidieron con las reacciones adversas a Dexdomitor. Un animal del Grupo 2 desarrolló una erupción cutánea después de la infusión de EBT-001. Se midió el ARN viral en plasma durante el curso de la infección y después de EBT-001 (Fig. 2D, E).

Diseño de estudio inicial n = 10 (A), diseño de estudio de seguimiento n = 2 (B), cuadro de estudio con los grupos 1-4 identificados (C), cargas virales plasmáticas individuales (log10 copias/mL de plasma) (D) y media y SEM de cargas virales plasmáticas de 4 grupos (E). El negro pertenece al Grupo 1 sin tratar; el rojo es el Grupo 2, 1012 GC/kg; el azul claro es el Grupo 3, 1013 GC/kg; el azul oscuro es el grupo 4, 1014 GC/kg. La media y el SEM se muestran para el grupo en los días posteriores a la infección. Terapia antirretroviral ART, CHOP Children's Hospital of Philadelphia, copias del genoma GC, intravenoso, virus de inmunodeficiencia simia SIV, subcutáneo cuadrado, dosis infecciosa media de cultivo de tejidos TCID50, Universidad UNC de Carolina del Norte.

Biodistribución del ADN del vector EBT-001 como log10 copias de ADN EBT-001 por µg de ADNg de mono en los principales reservorios tisulares del VIH (A) y otros tejidos, incluidas varias regiones del cerebro (B). Los símbolos representan animales individuales y se muestran la media y el SEM. ADNg, ADN genómico; SEM, error estándar de la media. La mayoría de los animales no tratados no recibieron EBT-001, pero se les realizó la necropsia al mismo tiempo que los animales con EBT-001 tratados durante 3 meses. ND no determinado.

Se analizaron muestras de plasma para detectar anticuerpos neutralizantes contra AAV9 antes del estudio y en la necropsia (Tabla S4). El tratamiento con EBT-001 se asoció con aumentos en los anticuerpos neutralizantes de AAV9 3 o 6 meses después del tratamiento en relación con los valores previos a la dosis. Los títulos previos a la dosis (valores de dilución recíproca en suero) fueron bajos (<5 y 80), excepto CF63, que tenía un título previo a la dosis de 320. Los valores en la necropsia oscilaron entre 80 y 5120 en los animales tratados con EBT-001 y fueron más alto en los monos sacrificados 6 meses después de EBT-001. Es de destacar que el título de CF63 no cambió después del tratamiento con EBT-001 a pesar de que era el más alto al inicio.

Todos los monos sobrevivieron hasta la eutanasia programada (3 o 6 meses después de EBT-001), cuando se realizó una necropsia completa a todos los animales (material y métodos complementarios). En general, las observaciones macroscópicas de la necropsia estuvieron dentro del rango normal, excepto por un solo animal (1T6, Grupo 1) del grupo tratado solo con ART, que estaba deshidratado y tenía una condición corporal delgada (puntuación de composición corporal de 2/5). Todos los hallazgos fueron consistentes con una infección por VIS (Tabla S5). No se observaron hallazgos patológicos macroscópicos o microscópicos relacionados con EBT-001 en una evaluación histopatológica integral de órganos principales realizada por Charles River Laboratories, LLC. Se observaron hallazgos microscópicos generales atribuidos a la infección crónica por VIS en todos los grupos de tratamiento e incluyeron hiperplasia linfoide mínima a leve de los centros germinales y la zona del manto del ganglio linfático mesentérico, hiperplasia linfoide de los folículos linfoides secundarios en la pulpa blanca del bazo y Infiltración de células mononucleares del corazón, riñón y pulmón. Además, hubo hiperplasia linfoide de las vainas linfoides periarteriolares del bazo en el animal BM79 (Grupo 4). No hubo diferencias aparentes en la frecuencia o gravedad de estos hallazgos en los monos tratados solo con TAR o en los monos tratados con TAR en combinación con EBT-001. En una evaluación neuropatológica separada realizada por Experimental Pathology Laboratories, Inc., los hallazgos en todos los macacos rhesus infectados con VIS fueron pocos y consistieron principalmente en hallazgos focales mínimos de microgliosis y, con menos frecuencia, astrocitosis y/o infiltrados perivasculares escasos de células mononucleares. En general, los hallazgos microscópicos fueron consistentes con una infección crónica por VIS y se observaron con una frecuencia similar en animales de control infectados por VIS examinados en los mismos momentos de otro estudio EBT-001. Por tanto, los hallazgos no se atribuyeron al tratamiento con EBT-001.

Para evaluar la biodistribución del vector en los tejidos en la necropsia, se utilizó un ensayo qPCR basado en TaqMan para cuantificar el ADN de EBT-001 (vector) (Charles River) (Fig. 3A, B). Todas las muestras de biodistribución de ADN y eliminación de vectores recolectadas de los animales no tratados (Grupo 1) fueron negativas, lo que demuestra que la contaminación estuvo bien controlada mediante la dosificación de animales, la necropsia, la extracción de ADN y el análisis de qPCR en este estudio. Se examinaron los tejidos que se consideran reservorios importantes de VIH/VIS, incluidos el bazo, los ganglios linfáticos, el colon, el compartimento de la médula ósea y la sangre para determinar la biodistribución del vector (Fig. 3A). Los niveles de ADN vectorial en el bazo oscilaron entre 4,82 y 6,44 (log10 copias de ADN de EBT-001/ug de ADN de mono). Para los ganglios linfáticos mesentéricos, el valor osciló entre 4,01 y 6,42 y para el colon entre 2,52 y 4,24 (log10 copias de ADN de EBT-001/ug de ADN de mono). En la médula ósea, el ADN del vector fue indetectable en el Grupo 2, 1,75–3,55 (log10 copias de ADN de EBT-001/ug de ADN de mono) en el Grupo 3, y 2 logs más en el Grupo 4 con un promedio de 5,5 (log10 copias de EBT-001). ADN/ug de ADN de mono). En la sangre, donde las células se renuevan rápidamente, el ADN vector solo se encontró en los 2 animales del grupo 3 a los que se les realizó la necropsia a los 3 meses después de EBT-001 y estuvo ausente en los animales del mismo grupo a los que se les realizó la necropsia a los 6 meses y en el grupo superior. el animal dosificado también se sacrificó a los 6 meses (Grupo 4) (Fig. 3A). Sin embargo, cuando se examinó la biodistribución en serie en sangre a partir de 2 semanas después de EBT-001, se detectó ADN del vector en los Grupos 2 y 3 y disminuyó con el tiempo (Figura S5). La concentración más alta de ADN de EBT-001 se detectó en las muestras de hígado de los Grupos 3 y 4 (Fig. 3B). Para el cerebro y otros tejidos, el Grupo 2 fue bajo o indetectable y la distribución aumentó en el Grupo 3 pero, curiosamente, los niveles en el Grupo 4 estaban en el rango de 4 (log10 copias de ADN de EBT-001/ug de ADN de mono). No se observó evidencia de eliminación del vector en heces u orina (no se muestra). Los resultados de qPCR confirman que EBT-001 se distribuyó ampliamente en la sangre y en todos los órganos y tejidos principales probados en animales a los que se les administró el vector. La biodistribución de EBT-001 (niveles de ADN) dependió de la dosis y los niveles del vector en cada tejido y sangre disminuyeron con el tiempo, aunque persistieron 6 meses después de la inyección en muchos tejidos.

La actividad de escisión del VIS se analizó en todos los grupos de tratamiento y tejidos. Los 2 gRNA en EBT-001 se dirigen a 3 ubicaciones en SIV y, por lo tanto, escinden 3 grandes segmentos provirales integrados de SIV. El gRNA LTR corta tanto el 5′ como el 3′LTR. Dado que esta guía se entrega junto con el ARNg de Gag, existe la posible eliminación de la secuencia de ADN del SIV proviral integrada intermedia entre 5′LTR y Gag, Gag hasta 3′LTR y entre 5′LTR y 3′LTR. . Se utilizaron dos ensayos para demostrar la escisión de 5'LTR a Gag (5G) y Gag a 3'LTR (G3) en tejidos y sangre (consulte Material y métodos complementarios y Tabla complementaria 3). La evidencia de escisión se detectó mediante la observación de productos de PCR anidados de distintos fragmentos de ADN de 268 o 171 pb resultantes de la eliminación de secuencias de ADN intermedias entre 5'LTR y Gag (5G) o Gag a 3'LTR (G3), respectivamente ( Figura 4A, C). El ensayo 5 G también amplificó el SIV de longitud completa con un tamaño de amplicón de 1282 pb. Debido a la extensa homología entre las secuencias 5' y 3'LTR y la falta de secuencias flanqueantes estandarizadas debido a la integración cromosómica aleatoria del ADN proviral del VIS, no fue posible medir el tercer producto de escisión que elimina todo el 5'LTR a 3'. ′Porción LTR. Ambos ensayos de escisión basados en PCR (5G y G3) se completaron (por duplicado por 2 operadores) para sangre y pequeñas secciones de tejidos y órganos, incluyendo: médula ósea, cerebro (tronco encefálico, cerebelo, frontal, occipital, parietal, prefrontal, cortezas temporales), colon, duodeno, corazón (ventrículo izquierdo, aurícula izquierda, ventrículo derecho, aurícula derecha), riñones, hígado, pulmones, ganglios linfáticos mesentéricos, bazo y testículos (Fig. 4, Tablas S6 y S7). Los datos de 5G y G3 se resumen en la Tabla S6 para tejidos y en la Tabla S7 para sangre. En la Fig. 4B para tejidos y en la Fig. 4D para extracciones de sangre en serie, la escisión positiva, definida por la detección del producto de PCR anidado de distintos fragmentos de ADN de 268 pb (5G) o 171 pb (G3) o ambos, está representada por una caja negra. La ausencia de escisión, definida por la ausencia de detección de cualquiera de los productos de PCR anidados de 268 pb (5G) o 171 pb (G3), se representa mediante un cuadro gris. Si no se pudo amplificar ningún producto de longitud completa (banda superior de 1282 pb solo en 5G) o extirpado (tanto en 5G como en G3), esto se representa mediante un cuadro blanco. Este análisis demostró la escisión del ADN del VIS en una amplia gama de tejidos, 3 y 6 meses después del tratamiento con vector. Se observó escisión viral de SIV, 5'LTR a Gag o Gag a 3'LTR, en algunos tejidos de todos los animales tratados con EBT-001. Se observó variabilidad animal individual, así como diferencias en la escisión de tejidos. La escisión se detectó a los 3 meses y en algunos tejidos a los 6 meses. No se detectó virus en algunas muestras de tejido con la dosis más alta de EBT-001 (Grupo 4) 6 meses después de EBT-001, lo que puede indicar la eliminación del ADN viral de esas secciones de tejidos. Los resultados del análisis de la actividad de escisión mostraron escisión del ADN del VIS en una amplia gama de tejidos 3 y 6 meses después del tratamiento con vector, y en sangre de 2 a 10 semanas después del tratamiento con vector, incluida la presencia de escisión del VIS en la sangre de un animal (BM79 ) en la necropsia (Fig. 4D). Dado que el ensayo 5G EXA amplifica tanto el virus de longitud completa (1282 pb) como el amplicón (268 pb) del producto de escisión después de la eliminación de las secuencias de ADN intermedias entre 5'LTR y Gag, calculamos el porcentaje de eficiencia de la escisión 5G. (Tablas S8 y S9, Fig. S6, Material y métodos complementarios). Entendemos las limitaciones de este ensayo basado en PCR, ya que es semicuantitativo y es posible que los productos de escisión más pequeños se amplifiquen de manera más eficiente que el virus intacto. Además, este ensayo refleja solo uno de los 3 posibles productos de escisión que pueden ocurrir mediante el corte de EBT-001. A pesar de las limitaciones de la detección del ensayo, los resultados muestran diferentes capacidades de escisión y se informó que varios animales tuvieron una escisión detectable en secciones de tejido examinadas, incluso en dosis más bajas.

Ejemplo de PCR 5G y G3 de tejidos de necropsia de mono MA285 (A). Presencia de escisión viral (mostrada como cuadros negros), ausencia de escisión viral (cuadros grises) o ausencia de producto extirpado y de longitud completa (cuadros blancos) en múltiples tejidos en la necropsia (B). Ejemplo de PCR 5G y G3 a partir de sangre de animales BM79 y CP26 antes de EBT-001 y 4, 5 y 6 meses después de EBT-001 (C). Presencia de escisión viral (cuadro negro) o ausencia de escisión viral (cuadros grises) de la sangre de animales después de EBT-001 (D). La línea de puntos representa el momento de la necropsia de 3 o 6 meses. No se obtuvo sangre de los animales con 1014 GC/kg entre 0,5 y 3,0 meses después de EBT-001 debido al cierre de COVID. Recuento del genoma GC, mes en el ganglio linfático mesentérico, reacción en cadena de la polimerasa por PCR, virus de inmunodeficiencia simia SIV.

Se midió el peso (kg) de cada mono durante el transcurso del estudio. Observamos que los animales del Grupo 1 (no tratados, mantenidos con TAR) continuaron perdiendo peso durante el estudio, mientras que los grupos tratados con EBT-001 mantuvieron su trayectoria de aumento de peso como se esperaba para su grupo normal (tratados versus no tratados, P = 0,029 ) y los animales con la dosis más alta tuvieron los mayores aumentos de peso (Fig. 5A). Entre la cohorte que recibió la dosis más alta de EBT-001, ningún animal experimentó pérdida de peso y ambos tuvieron aumentos en el recuento absoluto de linfocitos (Fig. 5B) sin un aumento de monocitos (Fig. 5C). No se observaron cambios en el colesterol, la glucosa, el fósforo, el calcio, la globina y la proteína total en los animales tratados con EBT-001 al comparar la preinfección, antes de la EBT-001 con los 3 meses posteriores a la EBT-001 (Fig. 5D-I) . Sin embargo, el animal tratado solo con ART, IT6, tenía leucopenia grave (Fig. 5B), hipofosfatemia moderadamente grave (Fig. 5F), hipocalcemia moderada (Fig. 5G), anemia grave e hipoproteinemia (Fig. 5H, I). Además, el animal no tratado, 7S0, tenía una marcada hipoglucemia (Fig. 5E).

La media (SEM) de los pesos de los animales se muestra como cambio porcentual del peso anterior a EBT-001. Los pesos de los tratados con EBT-001 (líneas roja, azul claro y azul oscuro) aumentan significativamente en comparación con los no tratados (negro) (P = 0,029). Se utilizó un modelo lineal de efectos mixtos para comparar el cambio porcentual en el peso desde antes de EBT-001 a lo largo del tiempo entre los grupos tratados y no tratados. La significación estadística se basó en un nivel alfa bilateral inferior a 0,05 (A). Se muestra el cambio en el recuento de linfocitos a partir de los datos del CBC con respecto a los valores promedio anteriores a EBT-001. Cada símbolo es un animal y se muestra como la media y SEM (B). Se muestra el cambio en el recuento de monocitos a partir de los datos de CBC con respecto a los valores promedio anteriores a EBT-001. Cada símbolo es un animal y se muestra como la media y SEM (C). Los diagramas de puntos de dispersión muestran la media y SEM, donde cada símbolo representa un animal antes de la infección, antes de EBT-001 y 3 meses después de EBT-001 para colesterol (D), glucosa (E), fósforo (F), calcio (G), globina (H), proteína total (I), ALP (J), ALT (K) y AST (L). Las citoquinas medidas por MSD a lo largo del tiempo después de EBT-001 se muestran para animales individuales para IFN-gamma (M) en plasma, IL-7 (N) en plasma y IL-15 (O) en plasma. ALP fosfatasa alcalina, ALT alanina transaminasa, terapia antirretroviral ART, AST aspartato transaminasa, hemograma completo, interleucina IL, mes Mo, descubrimiento de mesoescala MSD, error estándar SEM de la media, virus de inmunodeficiencia simia SIV.

No se observaron cambios notables en la química clínica o los parámetros hematológicos en los animales tratados con EBT-001 antes de la infección, antes de EBT-001 o 3 meses después de EBT-001 (Fig. 5J-L). Sin embargo, la evaluación de laboratorio del día 6 posterior a la dosis de EBT-001 de los 2 animales del Grupo 4 (dosis más alta) mostró aumentos transitorios en las concentraciones séricas de las enzimas hepáticas, fosfatasa alcalina (ALP), alanina transaminasa (ALT) y aspartato aminotransferasa ( AST) y en la bilirrubina sérica total (denominadas colectivamente pruebas de función hepática) (Fig. S7). Es importante destacar que las pruebas de función hepática elevadas regresaron a los valores del rango inicial en ambos NHP dentro de 1 a 8 semanas (Tabla S10), y no se observó evidencia de necrosis hepática u otros signos de lesión hepática mediante examen microscópico en la finalización programada del estudio en 6 meses después de la dosificación. Se examinaron las citoquinas interferón (IFN) gamma, interleucina (IL) -7 e IL-15 (Fig. 5M-O) en plasma de animales después de EBT-001 para detectar respuestas adversas de citoquinas a AAV9 y respuestas inmunes. El IFN-gamma solo se elevó en un animal no tratado y en ninguno del grupo tratado con EBT-001 (Fig. 5M). La IL-7, importante en el desarrollo de células T y la destrucción del VIH, aumentó en un animal del Grupo 4 y la IL-15, que activa las respuestas virales mediadas por células asesinas naturales (NK), tendió a aumentar en los animales tratados (Fig. 5N). –O).

Se analizó el potencial de edición no deseada de los NHP tratados con EBT-001 en ganglios linfáticos mediante análisis de secuenciación del genoma completo (WGS) para proporcionar un medio para identificar posibles eventos de edición no deseada en todo el genoma. La WGS se realizó con muestras de ADN genómico de biopsias de ganglios linfáticos recolectadas de 2 NHP, CK49 y CH97, antes de recibir EBT-001 y de los mismos animales después de 3 o 6 meses de tratamiento con EBT-001, respectivamente. WGS se realizó utilizando una secuenciación de extremos emparejados de 2 × 150 pb y una profundidad de cobertura promedio de ~ 30 ×. Para alinear y procesar eficazmente las lecturas de secuenciación, se diseñó una canalización en el entorno virtual integrado de alto rendimiento (HIVE), un entorno basado en la nube optimizado para el almacenamiento y análisis de datos extragrandes, como NGS (9; texto complementario) . Al evaluar la edición no deseada, nos centramos en los sitios nominados con una homología relativamente mayor con las secuencias guía. Las tasas de indel se calcularon para loci genómicos dentro de 10 pb de sitios de corte hipotéticos de cada locus nominado. Cuando comparamos las muestras de ganglios linfáticos tratadas con las no tratadas, la evaluación inicial identificó 5 sitios que tenían números significativamente diferentes de SNP (Tabla 2) usando la prueba de chi-cuadrado de dos colas con el procedimiento de Benjamini-Hochberg para controlar la tasa de descubrimiento falso (FDR). ). Observamos que todos estos SNP ocurren en una ubicación distante del sitio de corte hipotético (7 a 10 bases de distancia) y se muestran SNP tanto en muestras tratadas como en muestras no tratadas. Un examen más detallado de estos sitios ha demostrado una falta de evidencia para atribuir estos cambios a la edición de genes debido a que las alineaciones son demasiado ruidosas, tienen largos tramos de T alrededor del sitio potencial que pueden resultar en una alineación ambigua o una cobertura baja (texto complementario). Además, se observó que el cambio relativo de la frecuencia de los SNP no fue consistente entre los dos animales seleccionados en los 5 sitios. Por lo tanto, concluimos que faltan pruebas de una actividad de edición fuera del objetivo. También analizamos variantes estructurales entre estos sitios nominados, no detectamos lecturas que respalden alineamientos parciales dentro de ventanas de 40 pb que rodean los sitios de corte nominados. Además, analizamos posibles eventos de integración de AAV mediante la búsqueda de lecturas quiméricas con alineación parcial. En comparación con las muestras antes del tratamiento, el análisis encontró solo 2 lecturas potenciales en CH97 después del tratamiento y 1 lectura en CK49 después del tratamiento. Las 2 lecturas del postratamiento de CH97 fueron idénticas entre sí, posiblemente duplicados de PCR, y mostraron una alineación parcial con Chr7:128862755–128862834 con una alineación parcial con la región codificante de Cas9 (EBT001: 2636–2565). La lectura 1 en CK49 después del tratamiento también mostró una alineación parcial con la región codificante de Cas9 (EBT001: 2944–3037) y parcialmente alineada con Chr12: 28738543–28738586 (Fig. S8). Sin embargo, se observó que entre estas tres lecturas, ninguna de sus respectivas lecturas finales emparejadas apoyó los resultados de alineación parcial. En conjunto con la cantidad extremadamente pequeña de lecturas de respaldo, llegamos a la conclusión de que ninguno de los 3 saltos de lectura dividida puede atribuirse como evidencia de la integración de AAV en los ganglios linfáticos después del tratamiento con EBT-001.

El tratamiento de monos rhesus infectados con VIS con AAV9 CRISPR-Cas9 y ARNg duales dirigidos a VIS LTR y Gag (EBT-001) mostró una amplia biodistribución tisular y evidencia de edición del ADN proviral de VIS en todos los reservorios virales principales. EBT-001 fue bien tolerado en dosis de 1,4 × 1012 GC/kg, 1,4 × 1013 GC/kg y 1,4 × 1014 GC/kg. No hubo signos clínicos de toxicidad ni patología macroscópica anormal ni histopatología de órganos atribuida a EBT-001. Un animal experimentó una reacción relacionada con la infusión que se cree que se debe a la anestesia ya que los síntomas comenzaron después de la administración de la anestesia y antes de la infusión de EBT-001, y otro animal desarrolló una erupción en el lugar de la infusión. Se observaron aumentos transitorios de las enzimas hepáticas y de la bilirrubina sérica total con la dosis más alta. Las elevaciones en las pruebas de función hepática después del tratamiento con EBT-001 pueden representar una inflamación hepática aguda resultante del tratamiento. Es importante destacar que las pruebas de función hepática elevadas regresaron a los valores del rango inicial en ambos NHP dentro de 1 a 8 semanas. La naturaleza transitoria de las elevaciones, combinada con la ausencia de evidencia histopatológica de lesión hepática 6 meses después del tratamiento, indican que los efectos sobre la función hepática fueron reversibles.

Una observación interesante fue la ausencia de pérdida de peso entre nuestra cohorte infectada por VIS que recibió EBT-001, en contraste con la observación de pérdida de peso observada en los PNH del grupo que solo recibió TAR. Curiosamente, entre nuestros NHP que recibían la dosis más alta (1,4 × 1014 GC/kg) de EBT-001 y no mostraban signos de pérdida de peso, también notamos mejoras en sus recuentos absolutos de linfocitos en 6 meses. Aunque no disponemos de datos de animales no tratados a los 6 meses, EBT-001 no provocó una elevación del IFN-gamma. Se examinaron otras citocinas, incluida la IL-10, pero fueron indetectables o no se observaron cambios. Un animal en el grupo de dosis más alta, BM79, tenía niveles elevados de IL-7 e IL-15 a los 6 meses, pero sin un control exclusivo de VIS en este momento es difícil delinear si esto es en respuesta a AAV o VIS. Además, los datos sugieren que EBT-001 podría beneficiar potencialmente al sistema inmunológico mediante la recuperación de linfocitos, el desarrollo de células T y el mantenimiento de las células NK.

Una de las principales preocupaciones con el uso de terapias genéticas en humanos es su potencial para inducir respuestas inmunológicas que pueden tener efectos clínicos adversos [14,15,16]. Estos efectos adversos pueden resultar de la presencia de anticuerpos preexistentes contra la cápside de AAV, anticuerpos preexistentes contra Cas9 [17], la formación de anticuerpos contra la cápside de AAV después del tratamiento con vector, la formación de anticuerpos contra el transgén o su producto. , o de respuestas inmunes menos específicas [15]. La prevalencia de anticuerpos contra el VAA es similar en personas con y sin VIH y es similar a la prevalencia en los PNH. AAV9 es uno de los serotipos con la frecuencia más baja de anticuerpos preexistentes en la población humana, con ~33,5 % de las personas con un título de nAb AAV9 [18, 19]. En nuestros estudios, se observaron aumentos en los anticuerpos neutralizantes anti-AAV9 en los grupos de dosis más altas (Grupos 3, 4) a los 6 meses después de la administración de EBT-001. No vimos evidencia de ataque de tipo ADCC al tejido normal en animales portadores de anticuerpos y la patología fue similar en todos los animales. La escisión del ADN del VIS todavía era evidente, como se observó en la sangre de animales individuales en el primer momento analizado (2 semanas después de la administración de EBT-001) y hasta 6 meses después de la administración del vector. Además, ni los monocitos ni el IFN-gamma aumentaron en los animales tratados con EBT-001, lo que habría indicado una respuesta inflamatoria a EBT-001 o AAV9.

EBT-001 se distribuyó bien en los principales órganos y tejidos identificados como reservorios virales del VIH, incluido el cerebro, un reservorio importante para la cura del VIH [20, 21]. La expresión del ADN de EBT-001 se detectó de manera dependiente de la dosis y del tiempo. En general, los animales que recibieron la dosis 1012 tuvieron copias log10 más bajas de ADN de EBT-001 en comparación con los animales que recibieron las dosis 1013 o 1014 y tuvieron niveles indetectables en el momento de la necropsia en algunos tejidos, como el compartimento de la médula ósea, el cerebro y el músculo esquelético. y testículos. Los niveles de ADN de EBT-001 en sangre disminuyeron con el tiempo como se esperaba y el ADN de EBT-001 solo se detectó en el sangrado terminal en animales tratados con la dosis de 1013 y a los que se les realizó la necropsia 3 meses después de la infección. Para los estudios de curación del VIH, no es necesaria la expresión sostenida de EBT-001 y aún no se conoce la dosis de AAV necesaria en el entorno clínico.

La actividad farmacológica de edición de genes de EBT-001 se demostró mediante la detección de la escisión del ADN del VIS, la eliminación de secuencias de ADN intermedias entre 5′LTR y Gag y/o Gag hasta 3′LTR, en órganos y tejidos analizados a los 3 y 6 meses. después de la administración del vector. El ensayo 5G detecta el amplicón que une la región extirpada entre 5'LTR y Gag; mientras que el ensayo G3 detecta el amplicón que une la región extirpada entre Gag y 3'LTR. Es de destacar que existen tres posibles productos de escisión que pueden resultar cuando se utilizan ARNg dirigidos a LTR y Gag. Debido a la homología entre las LTR 5′ y 3′, actualmente solo 2 de las 3 escisiones son medibles. Por lo tanto, posiblemente estemos subestimando la escisión ya que no podemos detectar evidencia de la escisión completa de 5′ a 3′LTR. Sin embargo, el éxito de cualquiera de las 3 posibles escisiones hará que el virus no pueda replicarse.

Con cualquier plataforma de edición de genes, los posibles efectos fuera del objetivo son una preocupación que debe ser monitoreada. Mitigamos esta preocupación en este estudio mediante búsquedas bioinformáticas del genoma del macaco rhesus que no revelaron resultados de sitios genómicos con 1, 2 o 3 discrepancias con la guía y el motivo adyacente al protoespaciador (PAM). Se identificó un sitio para la guía LTR que tenía dos discrepancias y un bulto. Se obtuvieron pocos sitios con 4 o 5 diferencias entre las guías y el genoma del macaco rhesus (Tabla 1). Los ensayos para posibles eventos fuera del objetivo para EBT-101 en ratones humanizados infectados con VIH-1 no revelaron actividad detectable después del tratamiento con las guías dirigidas al VIH [6]. Se realizaron estudios similares para probar el homólogo de VIS EBT-001 en un pequeño estudio de una cohorte de dosis única de NHP infectados por VIS [4]. Para analizar posibles ediciones no deseadas en este estudio, los ensayos buscaron indeles y la posibilidad de cambios mayores, incluidas inserciones, eliminaciones, inversiones, translocaciones u otros reordenamientos cromosómicos. Estudios anteriores que mapean los efectos de la edición CRISPR utilizando una variedad de diferentes ARNg encontraron predominantemente eliminaciones o inserciones de un solo nucleótido, una frecuencia más baja de diferentes indeles pequeños y frecuencias mucho más bajas de eliminaciones e inserciones más grandes [22, 23]. Cuando se produjeron eliminaciones más grandes, se encontraron indeles más pequeños con mayor frecuencia. Por lo tanto, nuestro análisis incluyó la búsqueda tanto de indeles como de posibles cambios mayores. Una marcada ventaja de los estudios combinados es la oportunidad de utilizar múltiples canalizaciones simultáneamente para analizar una posible edición fuera del objetivo y los datos de una canalización para mejorar la precisión de los datos en otras canalizaciones. Por ejemplo, si se detectaran cambios estructurales o inserción de AAV en sitios de edición fuera del objetivo, estos eventos hipotéticos estarían respaldados por evidencia del análisis de indeles que se observó que ocurrían en los mismos sitios cromosómicos con un mayor número de indeles confirmados por secuencia. Por lo tanto, el uso simultáneo de canalizaciones para indeles, variación estructural e inserciones de AAV puede ayudar a analizar posibles sitios de edición de baja frecuencia. Aquí, WGS se realizó sin detectar eventos de edición no deseados y sin evidencia concluyente de inserciones de AAV o SaCas9, variaciones estructurales o alteración de un gen, debido a la edición CRISPR de EBT-001. Estos estudios de NHP observaron la actividad de escisión prevista del VIS en múltiples tejidos estudiados sin ninguna edición no intencionada detectable.

Este estudio fue diseñado como un estudio preclínico para la seguridad y tolerabilidad de EBT-001 en un modelo animal grande de VIH. Para modelar con mayor precisión el EBT-101, las guías SIV no se optimizaron para lograr eficiencia de corte, sino que se seleccionaron para apuntar a las mismas regiones LTR y Gag. Además de las secuencias guía, EBT-001 y EBT-101 se componen de un vector de administración todo en uno idéntico. Las limitaciones de nuestro estudio son el pequeño número de animales por grupo, el tiempo limitado en TAR antes de EBT-001 y la falta de una interrupción del tratamiento analítico. El estudio no fue diseñado para probar el efecto sobre el reservorio viral intacto, ya que EBT-001 se administró cuando el reservorio viral no era estable y todavía había replicación viral activa. Además, como los animales se mantuvieron con TAR, no probamos la capacidad de EBT-001 para extender el tiempo hasta el rebote viral o eliminar la reactivación viral después de una interrupción del tratamiento analítico. En conjunto, los datos de biodistribución y seguridad respaldan el desarrollo continuo de ARNg dual CRISPR-Cas9 administrado por AAV9 para estrategias de cura para la erradicación del VIH.

Todos los datos están disponibles en el texto principal o en los materiales complementarios. Los datos de secuenciación del genoma completo se depositan en NCBI SRA con el número de acceso PRJNA957550.

Policicchio BB, Pandrea I, Apetrei C. Modelos animales para la investigación de la cura del VIH. Inmunol frontal. 2016;7:12.

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Terrade G, Huot N, Petitdemange C, Lazzerini M, Resendiz AO, Jacquelin B, et al. Intereses de los modelos de primates no humanos para la investigación de la cura del VIH. Vacunas. 2021;9:958.