La fijación de metanol es el método de elección para las gotitas.

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 522 (2023) Citar este artículo

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El principal paso crítico en la transcriptómica unicelular es la preparación de la muestra. Se han desarrollado varios métodos para preservar las células después de la disociación para desacoplar la manipulación de muestras de la preparación de la biblioteca. Sin embargo, la idoneidad de estos métodos depende de los tipos de células que se van a procesar. En este proyecto, realizamos una comparación sistemática de métodos de preservación para secuencias de ARN unicelulares basadas en gotitas en células neurales y gliales derivadas de células madre pluripotentes inducidas. Nuestros resultados muestran que, si bien el DMSO proporciona la mayor calidad celular en términos de moléculas de ARN y genes detectados por célula, afecta fuertemente la composición celular e induce la expresión de genes de estrés y apoptosis. Por el contrario, las muestras fijadas con metanol muestran una composición celular similar a la de las muestras frescas y proporcionan una buena calidad celular y pocos sesgos de expresión. En conjunto, nuestros resultados muestran que la fijación de metanol es el método de elección para realizar experimentos de transcriptómica unicelular basados en gotas en poblaciones de células neurales.

Los métodos de transcriptómica unicelular (scRNA-seq) han revolucionado la forma en que estudiamos de manera de alto rendimiento la expresión de genes en individuos, tejidos e incluso en enfermedades1,2,3. Anteriormente, los estudios se limitaban a identificar cambios en los niveles de expresión de genes en masa, es decir, en la población de células que componían una muestra particular. Por tanto, estos enfoques mezclaron dos efectos diferentes: cambios en la composición celular de la muestra de interés y cambios en la expresión de genes dentro de células individuales. Ahora, scRNA-seq permite evaluar estos dos efectos de forma independiente y puede detectar tanto cambios en la composición celular4,5 como la expresión de genes en tipos celulares específicos6,7.

A pesar de la popularidad de los métodos scRNA-seq, todavía quedan varios desafíos técnicos sin resolver. Por ejemplo, la disociación de las células de un tejido y la obtención de una buena suspensión celular, necesaria para scRNA-seq, es altamente específica del tejido y puede requerir el uso de diferentes estrategias que incluyen digestión enzimática, disgregación mecánica, células activadas por fluorescencia. clasificación y otras tecnologías8,9,10,11,12. Como resultado, la preparación de muestras para scRNA-seq puede llevar varias horas, lo que hace que sea más conveniente procesarlas en momentos posteriores. Además de las dificultades técnicas, la preservación de las células también es importante si necesitamos desacoplar la disociación y el procesamiento de muestras por otros motivos, como el envío de muestras a una instalación externa, o si queremos recolectar varias muestras y procesarlas juntas en un momento posterior. para ahorrar tiempo o dinero. En todos estos casos, a los investigadores les gustaría preservar estas muestras de una manera que minimice las diferencias en la composición celular y la expresión genética de las células individuales en comparación con la muestra original. Es decir, el mejor método de conservación será aquel que tenga el menor impacto en la composición celular de la muestra y el perfil transcriptómico de las células individuales.

Ya se han desarrollado varios métodos de conservación de células para superar este problema y desacoplar el manejo de muestras de la preparación de la biblioteca. Entre ellas, encontramos soluciones tanto caseras como comerciales que incluyen la fijación con metanol13,14, propionato de ditio-bis succinimidilo15, criopreservación con dimetilsulfóxido (DMSO)16,17, acético-metanol (ACME)10, paraformaldehído18, CellCover17 y vivoPHIX19. Estos métodos tienen como objetivo mantener la composición de la muestra y la calidad del ARN de las células. Sin embargo, teniendo en cuenta que la preparación de muestras es específica de cada tejido, esperamos que diferentes métodos de conservación sean óptimos para diferentes muestras. Muchos de estos protocolos se han probado sólo en líneas celulares o células fáciles de obtener, como las células de sangre periférica, y por lo tanto, no está claro cómo funciona su desempeño en células que son difíciles de disociar o que se dañan potencialmente durante la disociación. En particular, ninguno de los métodos anteriores se ha probado en neuronas maduras o en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC), que son la principal fuente de células neuronales para estudiar los mecanismos moleculares que impulsan las enfermedades neurológicas20.

En este trabajo, hemos comparado el rendimiento de cinco métodos populares de fijación o preservación en células neurales y gliales derivadas de hiPSC. Los resultados de nuestro trabajo muestran que los diferentes métodos de conservación/fijación afectan a las muestras de diferentes maneras, incluidos sesgos en el perfil transcriptómico, la composición celular y la complejidad de la biblioteca. La criopreservación con DMSO proporciona la más alta calidad celular en términos de complejidad de la biblioteca. Sin embargo, los conjuntos de datos obtenidos están muy agotados en neuronas y muestran una firma de estrés más fuerte. Por el contrario, ACME y vivoPHIX no afectan significativamente la composición celular de las suspensiones unicelulares, pero dañan el ARN, lo que reduce la complejidad de la biblioteca y, por tanto, la cantidad de genes y moléculas de ARN detectadas en células individuales. En conjunto, nuestros resultados muestran que la fijación de metanol es el método de elección para realizar experimentos de transcriptómica unicelular basados en gotas en poblaciones de células neurales, ya que proporciona una alta complejidad de biblioteca sin afectar la composición celular ni la expresión genética en comparación con muestras frescas.

Las líneas celulares hiPSC individuales o agrupadas se diferenciaron en neuronas corticales utilizando un protocolo previamente descrito con modificaciones menores. Brevemente, se sembraron colonias de hiPSC en placas de 12 pocillos recubiertas con matrigel y, después de alcanzar la confluencia, se indujo la diferenciación neural utilizando una combinación de inhibidores de BMP (noggin, dorsomorfina y SB431542) (Fig. 1a). Después de 29 a 50 días de diferenciación, las células se disociaron con una solución de papaína accutasa para obtener una suspensión unicelular (Datos complementarios 1). En este punto, algunas de las muestras se encapsularon directamente usando la configuración automática Drop-seq de Dolomite Bio NADIA (fresco), se criopreservaron con DMSO17 o se conservaron usando metanol14,22, ACME10 o componentes químicos que estabilizan las moléculas de ARN como vivoPHIX19 y CellCover17. que se han utilizado previamente en transcriptómica unicelular (Fig. 1b).

a Representación esquemática del protocolo de diferenciación de hiPSC en células progenitoras neurales. b Comparación sistemática de métodos de conservación. Después de la diferenciación de las hiPSC, todas las células se disociaron utilizando papaína accutasa y se encapsularon o conservaron directamente utilizando uno de los diferentes reactivos probados. Después de conservarlas, las células se descongelaron o rehidrataron y se encapsularon utilizando una configuración comercial Drop-seq utilizando los mismos protocolos.

Antes de realizar el análisis transcriptómico unicelular, investigamos si la preservación de suspensiones unicelulares afecta la calidad del ARN obtenido. Para ello, extrajimos el ARN total de células precursoras neurales (NPC) frescas y conservadas almacenadas a -80 °C o 4 °C durante hasta 15 días. Para cada una de las muestras, cuantificamos la cantidad total de ARN y evaluamos su calidad mediante el sistema Agilent TapeStation. Nuestros resultados mostraron que la calidad del ARN extraído dependía del método de conservación utilizado. Las muestras de DMSO, metanol y ACME tenían valores de número de integridad de ARN (RIN) muy altos (~9), similares a los de las muestras frescas. Por el contrario, la muestra vivoPHIX tuvo cierta degradación del ARN (RIN ~7) y las muestras procesadas con CellCover tuvieron niveles de degradación más fuertes, con valores de RIN ~2 a 4 °C y ~6 a −80 °C (Figura 1 complementaria). Estos resultados demuestran que CellCover no es adecuado para el almacenamiento a largo plazo de células para transcriptómica unicelular. Teniendo esto en cuenta, decidimos descartar CellCover para la comparación sistemática de métodos de conservación.

Para comparar el impacto de los diferentes métodos de preservación, las hiPSC se diferenciaron de las NPC y se conservaron utilizando uno de los diferentes métodos de preservación/fijación o se encapsularon directamente con el equipo NADIA, una configuración comercial Drop-seq (Fig. 1b). La encapsulación celular y la preparación de la biblioteca se realizaron siguiendo el mismo protocolo para todas las muestras. Luego, los conjuntos de datos obtenidos se evaluaron utilizando diferentes métricas para evaluar su calidad.

La inspección de los perfiles de ADNc mostró que las muestras de ACME y vivoPHIX tenían menos ADNc y fragmentos más pequeños que el resto de las bibliotecas (Fig. 2a), lo que concuerda con la degradación del ARN. Esto se esperaba en las muestras vivoPHIX, que ya mostraban una calidad de ARN más baja después de ser conservadas durante 2 semanas, pero no para las muestras ACME, que tenían valores de RIN similares a los de las muestras frescas (Figura 1 complementaria). A continuación, evaluamos el impacto de los métodos de preservación en la complejidad de la biblioteca. Usamos samtools23 para reducir la muestra de cada uno de los archivos BAM no alineados para producir archivos que contengan el 10%, 20%, 30%, etc. del conjunto de datos original. Luego, cada una de estas submuestras se procesó utilizando el mismo proceso computacional para generar matrices de expresión génica digital (DGE) con muestras reducidas. Nuestros resultados muestran que a la misma profundidad de secuenciación, las células criopreservadas con DMSO y las células fijadas con metanol producen un número comparable o mayor de genes e identificadores moleculares únicos (UMI) por célula que las células frescas. En comparación, a 7500 lecturas por célula, las muestras ACME y vivoPHIX tienen alrededor del 40% de los genes y UMI obtenidos en células frescas (Fig. 2b) (Datos complementarios 2). El mayor número de genes y UMI en las muestras de DMSO D1 y D2 y en las muestras fijadas con metanol M3 y M4 se debe a diferencias en la eficiencia de captura de las perlas utilizadas para la encapsulación y no a una mayor eficiencia de captura intrínseca en estas condiciones experimentales. (Figura complementaria 2 y Datos complementarios 1).

a Traza de las bibliotecas obtenidas después de la encapsulación, incluidas las frescas (F1 y F2), metanol (M1, M2, M3 y M4), DMSO (D1, D2 y D3), ACME (A1 y A2) y vivoPHIX (V1 y V2) muestras. Las bibliotecas de las muestras fijadas con vivoPHIX y ACME tienen fragmentos de menor tamaño y menos ARN, lo que concuerda con la degradación del ARN. b Gráficos de reducción de resolución que muestran el número de genes y UMI en función de la profundidad de secuenciación (lecturas medias por celda). En ambos casos, las bibliotecas de DMSO (azul) y metanol (verde) tienen una profundidad equivalente o superior a la de las muestras frescas (rojo). c Gráficos de violín que muestran el número de genes, UMI, el porcentaje de contenido mitocondrial (% MT) y el contenido ribosómico (% Ribo) de las células para cada muestra después de descartar células y dobletes de baja calidad. Los diagramas de caja incluidos dentro de los diagramas de violín resumen la distribución de los datos. Los lados superior e inferior del cuadro representan el primer y tercer cuartil. La línea del medio corresponde a la mediana. Las líneas no se extienden más allá de 1,5 del rango intercuartílico. d Gráficos de barras que muestran el porcentaje de UMI intrónicos y exónicos asignados a celdas para cada una de las bibliotecas. El número de lecturas intrónicas oscila entre ~10% en la muestra D1 de DMSO y ~30% en la muestra M4 de metanol. Las fracciones altas de UMI intrónico son indicativas de fuga de ARN celular o enriquecimiento de ARN nuclear.

La menor complejidad de las bibliotecas vivoPHIX y ACME también se refleja en la proporción de células de baja calidad en las muestras, que tienen pocos UMI y genes detectados por célula (Fig. 2c y Tabla 1), y pueden corresponder a gotitas vacías o gotitas que contienen células rotas24. Si bien la cantidad de células de baja calidad descartadas es de alrededor del 10% de las células en células frescas, DMSO y fijadas con metanol, esta cantidad aumenta hasta un 29% y un 49% en muestras ACME y vivoPHIX, respectivamente (Tabla 1 y Datos complementarios 3). ).

Después de descartar las células de baja calidad, las células vivoPHIX y ACME restantes aún muestran claras diferencias en la calidad (Fig. 2c y Tabla 1). Curiosamente, el porcentaje de UMI asignados a genes mitocondriales fue igualmente bajo en todas las muestras, lo que sugiere que la menor cantidad de ARN capturados en estas muestras puede no deberse a una fuga de ARN o daño celular24, sino más bien estar relacionado con la eficiencia de captura de ARN o la degradación de ARN. Además, las muestras de ACME mostraron una fracción mucho mayor de UMI asignadas a proteínas ribosómicas que cualquiera de las otras muestras (Fig. 2c), que también se ha asociado previamente con células de baja calidad o artefactos técnicos25.

Una de las razones por las que las células fijadas vivoPHIX y ACME tienen menos ARN por célula podría ser que el método de fijación facilita la rotura celular. En este caso, esperaríamos una menor complejidad de la biblioteca y una mayor fracción de lecturas provenientes de regiones intrónicas, que provienen principalmente de pre-ARNm y están enriquecidas en núcleos26,27. En nuestras muestras, la fracción de lecturas intrónicas provenientes de cada muestra fue variable según los métodos de preservación, desde el 10% en muestras de DMSO hasta ~30% en muestras de metanol y vivoPHIX (Fig. 2d). La mayor fracción de lecturas intrónicas in vivo de muestras de PHIX y metanol es indicativa de enriquecimiento de ARN nuclear26,27. Sin embargo, considerando que la cantidad de genes y UMI detectados en metanol es, en promedio, aproximadamente tres veces mayor que las muestras PHIX in vivo (Datos complementarios 2), la fuga de ARN probablemente no sea la causa de este sesgo. En conjunto, estos resultados demuestran que los métodos de conservación vivoPHIX y ACME afectan significativamente la calidad de los transcriptomas unicelulares obtenidos de poblaciones de NPC humanas, aunque esto no puede explicarse por una mayor fuga de ARN o rotura celular.

Después de evaluar las métricas de calidad generales de las muestras, investigamos si los métodos de conservación afectan la composición celular de las muestras. Para ello, reunimos todas las muestras y las analizamos juntas. El análisis inicial mostró un fuerte efecto del lote impulsado principalmente por el método de conservación utilizado. Como se puede ver en la Figura complementaria 3, antes de la integración, las celdas de diferentes experimentos ocupan diferentes regiones del gráfico de proyección y aproximación de variedad uniforme (UMAP) (Figura complementaria 3). Por lo tanto, utilizamos Harmony28 para integrar los conjuntos de datos e identificar las poblaciones celulares obtenidas de la diferenciación hiPSC (Fig. 3). Después de la corrección por lotes, identificamos 12 poblaciones de células correspondientes a progenitores proliferantes, NPC, precursores astrogliales, progenitores intermedios y diferentes tipos de neuronas caracterizadas por la expresión de genes marcadores específicos (Fig. 3, Figs. 4 y 5 complementarias, y Datos complementarios 4). y 5). Todos los grupos identificados estaban presentes en todas las muestras individuales. Sin embargo, la abundancia relativa de cada una de las poblaciones de células cambió según el método de conservación utilizado (Fig. 4a y Fig. 6 complementaria). Para investigar si estos cambios se debieron a sesgos experimentales o fueron sesgos sistemáticos debido al método de fijación, realizamos un análisis compositivo de las muestras con scCODA, una herramienta desarrollada recientemente que puede identificar de manera confiable cambios en conjuntos de datos unicelulares incluso con un nivel bajo. número de réplicas5. A diferencia de otros métodos, scCODA modela el sesgo compositivo de la muestra en su conjunto y no para cada grupo de forma independiente. Esto evita identificar erróneamente los cambios en la proporción de células debido al agotamiento de una población de células individuales, lo que daría lugar artificialmente al aumento de todas las demás poblaciones de células de la muestra. Para identificar cambios de composición, elegimos como grupo de referencia muestras frescas, de modo que los resultados indiquen si encontramos cambios de composición en relación con este grupo. Los resultados de este análisis resaltan un agotamiento significativo de las neuronas excitadoras en muestras criopreservadas de DMSO en comparación con muestras frescas, mientras que no encontramos sesgos de composición significativos en las muestras conservadas utilizando cualquiera de los otros métodos (Fig. 4b).

un gráfico UMAP que muestra las poblaciones de células identificadas en las muestras de NPC, que incluyen diferentes tipos de poblaciones de NPC, precursores astrogliales, progenitores intermedios y neuronas inmaduras tanto excitadoras como inhibidoras. b Presentar gráficos de genes marcadores conocidos que se han utilizado para identificar las poblaciones de células en (a), incluidos los marcadores NPC (SOX2), marcadores de proliferación (TOP2A y PCNA), marcadores de destino cortical (FOXG1), marcadores de destino dorsal (PAX3), techo marcadores de placa (PTN), marcadores astrogliales (ADGRV1 y GJA1), marcadores neuronales inmaduros (DCX), marcadores progenitores intermedios (HES6), marcadores neuronales inhibidores (GAD2) y excitadores (SLC17A6).

a Gráficos UMAP que muestran la distribución de células en grupos para cada uno de los métodos de fijación. Los grupos están coloreados como en la Fig. 3a. Las muestras conservadas en DMSO muestran un fuerte agotamiento de células en grupos neuronales en comparación con todas las demás muestras. b Gráfico de barras que muestra la proporción promedio de celdas asignadas a cada grupo para cada método. La altura de las barras representa el promedio de todas las muestras conservadas utilizando el mismo método. Los puntos negros representan la proporción de células en muestras individuales. * Indica muestras con una diferencia significativa en la proporción de células en una muestra particular en relación con muestras nuevas según lo predicho por scCODA, lo que significa que la puntuación promedio de la muestra está por debajo de cero según el modelo scCODA considerando una tasa de descubrimiento falso <0,05.

Finalmente, investigamos si los métodos de preservación inducían cambios en la expresión genética que podrían afectar la comparación entre muestras. Una comparación de la expresión genética entre muestras muestra una alta correlación entre todas las muestras (coeficiente de correlación de Pearson R > = 0,8), aunque las muestras ACME y vivoPHIX tienen correlaciones ligeramente más bajas con todas las demás muestras (Figura complementaria 7). Esta menor correlación puede explicarse por cambios globales o específicos del tipo de célula en la expresión genética, pero también por sesgos de composición. Para investigar esto más a fondo, generamos recuentos pseudobulk para cada uno de los grupos para cada muestra por separado y realizamos un análisis de correlación a nivel de grupo. Nuestros análisis muestran que el método de fijación induce sesgos en la agrupación de poblaciones de células entre muestras (Figura complementaria 8). Sin embargo, la gran similitud entre diferentes grupos, es decir, poblaciones de NPC, hace que los grupos de células preservadas con un método particular se agrupen. Para abordar este problema, evaluamos la agrupación de muestras para cada grupo de células de forma independiente utilizando sigclust229, un método estadístico diseñado para probar la significación estadística de la agrupación jerárquica. Como se puede ver en la Fig. 5, en todos los casos las muestras de metanol se agruparon con muestras frescas. Por el contrario, en 8 de las 12 poblaciones de células identificadas, varias muestras vivoPHIX y ACME se agrupan por separado de las muestras frescas. Por tanto, este análisis confirma que el perfil de expresión general de las células fijadas con metanol en cada grupo es más similar al de las células frescas que al de las células conservadas mediante otros métodos.

Dendrograma que muestra la similitud de los perfiles de expresión génica de las células de las diferentes muestras pertenecientes a un mismo grupo celular. Las muestras están etiquetadas de la siguiente manera: fresca (F1 y F2, color rojo), metanol (M1, M2, M3 y M4, color verde), DMSO (D1, D2 y D3, color azul), ACME (A1 y A2 , color morado) y vivoPHIX (V1 y V2, color magenta). La importancia en el agrupamiento jerárquico se evalúa mediante la prueba shc implementada en sigclust2. Las ramas importantes del dendrograma están resaltadas en rosa. *, ** y *** marcan las ramas con un valor P menor que 0,05, 0,01 o 0,001, respectivamente. Las ramas no significativas se resaltan en amarillo y las ramas no probadas en azul y verde.

Estudios anteriores han demostrado que los métodos de disociación y conservación pueden inducir estrés celular que se refleja a nivel transcriptómico9,30. En consecuencia, verificamos la expresión de genes tempranos inmediatos (IEG) y marcadores de apoptosis en nuestros conjuntos de datos. La firma del gen de la apoptosis fue mayor en las muestras de ACME, vivoPHIX y DMSO en comparación con las muestras frescas, y mayor en DMSO que en las muestras fijadas con metanol, aunque estas diferencias fueron mínimas (Fig. 6a). Todas las muestras fijadas tuvieron una mayor expresión de IEG que las muestras frescas, aunque las células criopreservadas con DMSO mostraron una mayor expresión de IEG que todas las demás muestras (Fig. 6b). Este resultado indica que la congelación y descongelación estresa las células de una manera que se refleja globalmente en el perfil transcriptómico de las células. Para investigar si la preservación celular indujo sesgos de expresión adicionales a nivel de grupo individual, utilizamos muscat31 para identificar genes expresados diferencialmente (DEG) específicos del tipo de célula en muestras fijas en comparación con muestras frescas (Datos complementarios 6). Nuestro análisis muestra que el número de genes expresados diferencialmente (DEG) es muy diferente entre los métodos de fijación. Mientras que las muestras vivoPHIX presentan muchos DEG en todos los grupos, la cantidad de DEG significativos es cercana a cero en las muestras de DMSO (Fig. 6c y Datos complementarios 6). Utilizamos el análisis de enriquecimiento de términos de ontología genética para investigar si diferentes métodos de fijación introducirían sesgos en la expresión genética relacionada con funciones particulares. Nuestros resultados no encontraron ningún término significativo sobrerrepresentado en genes constantemente regulados hacia arriba o hacia abajo en múltiples grupos de células, lo que sugiere que el efecto que tienen los métodos de fijación sobre la expresión génica en todos los grupos no está relacionado con funciones o ubicaciones celulares particulares.

a, b Gráficos de violín que muestran la distribución de las puntuaciones de enriquecimiento de las firmas de apoptosis (a) y estrés (b) en los métodos de preparación de muestras. Los diagramas de caja incluidos dentro de los diagramas de violín resumen la distribución de los datos. Los lados superior e inferior del cuadro representan el primer y tercer cuartil. La línea del medio corresponde a la mediana. Las líneas no se extienden más allá de 1,5 del rango intercuartílico. a La puntuación de enriquecimiento de apoptosis es mayor en muestras de DMSO, ACME y vivoPHIX en comparación con muestras frescas (asteriscos negros) y mayor en DMSO en comparación con metanol (asteriscos azules). b La firma de tensión es mayor para todos los métodos de fijación/preservación en comparación con muestras frescas (asteriscos negros), y también mayor en DMSO en comparación con todos los demás métodos de fijación (asteriscos azules). En todos los casos, la significación estadística se probó mediante una prueba de suma de rangos de Wilcoxon de una cola. Las comparaciones con productos frescos están marcadas con negro * y las comparaciones de DMSO con otros métodos de fijación están marcadas en azul. ** indica un valor de P <0,01; *** indica un valor de P <0,001. c Gráfico de barras que muestra el número de genes significativamente regulados hacia arriba y hacia abajo para cada método de fijación en cada grupo de células con un log2fc > = |0,58| y un valor P ajustado de la prueba de Wald <0,05. Las muestras de vivoPHIX y metanol tienen más DEG en todos los grupos, mientras que la cantidad de DEG en DMSO es cercana a cero.

Los métodos de transcriptómica unicelular se están convirtiendo en el nuevo estándar para estudiar los cambios transcriptómicos en muestras y condiciones. Estas tecnologías son relativamente nuevas en comparación con los métodos de transcriptómica masiva como RNA-seq o 3' seq. Así, en muchos casos aún no existen protocolos de preparación estándar para las diferentes muestras utilizadas. En este proyecto, hemos comparado cómo los métodos de conservación y fijación comúnmente utilizados afectan la composición celular y la expresión de poblaciones de células neurales y gliales derivadas de hiPSC. Por lo tanto, este trabajo amplía estudios anteriores que han comparado los efectos de un solo método de preservación sobre la calidad de los transcriptomas unicelulares o que se han centrado en sus efectos en diferentes tipos de células y, por lo tanto, pueden no ser aplicables a las células neurales13,14,15,16. ,17,18,19. Nuestros resultados muestran que los diferentes métodos de preservación/fijación afectan la calidad de los conjuntos de datos de transcriptómica unicelular de diferentes maneras, incluida una menor complejidad de la biblioteca, cambios en la composición celular y alteraciones en el perfil de expresión de las células individuales (Tabla 2).

En términos de complejidad de la biblioteca, las muestras ACME y vivoPHIX muestran una fuerte disminución en la cantidad de ADNc obtenido después de la encapsulación unicelular (Fig. 2a), lo que también se refleja en una menor detección de genes y UMI (Fig. 2b). En el caso de las muestras vivoPHIX, esto podría estar relacionado con una menor calidad inicial de la muestra de ARN, que tenía valores de RIN más bajos (Figura 1 complementaria). En el caso de las muestras ACME, que tenían una calidad de ARN equivalente a la de las muestras frescas, esta disminución es consistente con informes anteriores que muestran que la integridad del ARN disminuye en las muestras fijadas con ACME con el tiempo10. La menor complejidad de la biblioteca de estas muestras debido a una mayor tasa de abandono es probablemente la causa de los sesgos en el análisis de agrupamiento de la población celular (Fig. 5) y podría contribuir al número de DEG identificados en cada grupo (Fig. 6c y Suplementario). Datos 6).

Al observar la composición celular, nuestros resultados resaltan claramente un fuerte agotamiento de las células neuronales en las muestras criopreservadas con DMSO (Fig. 4). Para este proyecto se han utilizado diferentes líneas celulares y experimentos, lo que podría tener un efecto de confusión que afecte a la composición del tipo celular. Sin embargo, la comparación de muestras de DMSO y metanol que provienen exactamente de la misma diferenciación (M3, M4, D1 y D2) (Datos complementarios 1) resalta una clara diferencia en la abundancia relativa de poblaciones de neuronas excitadoras entre muestras de metanol y DMSO, lo que proporciona evidencia adicional de que los sesgos de composición se deben al procedimiento de fijación/preservación (Figura complementaria 6). Si bien se ha informado anteriormente que el DMSO es un excelente método de preservación celular para la transcriptómica unicelular16,17, ninguno de estos estudios analizó el efecto del DMSO en las células neuronales maduras. La reducción en el número de neuronas recuperadas podría deberse a la toxicidad del DMSO32,33 o a la gliosis reactiva inducida por DMSO, que ha sido reportada previamente y puede afectar a las células tras una exposición muy breve32, o simplemente a la mayor fragilidad de las neuronas que no lo hacen. sobrevivir a los ciclos de descongelación/congelación. Esto último podría explicar la mayor expresión de genes de estrés en muestras de DMSO en comparación con las muestras frescas y todas las demás muestras fijadas. Sin embargo, las neuronas obtenidas no muestran fuertes sesgos de expresión, ya que a menudo se agrupan con muestras frescas y fijadas con metanol y apenas no tienen DEG significativos (Fig. 6 y Datos complementarios 6). Si bien nuestros resultados demuestran que DMSO no es una buena opción para realizar análisis de composición de células derivadas de hiPSC, podría usarse para perfilar muestras neuronales puras cuando la disponibilidad de células no es un problema.

Nuestros análisis también demuestran que los diferentes métodos de fijación/preservación alteran la expresión genética de diferentes maneras. Los sesgos de expresión inducidos por la fijación pueden afectar el perfil de expresión general de los grupos de células, como es el caso de las muestras vivoPHIX y ACME (Fig. 5 y Figs. 7 y 8 complementarias), o impulsar cambios específicos del tipo de célula en la expresión génica (Fig. .6c y Datos complementarios 6). Además, hemos encontrado una mayor expresión de IEG en todas las muestras en comparación con las frescas, y una mayor expresión de marcadores de apoptosis en células vivo PHIX, ACME y DMSO en comparación con las frescas (Fig. 6a, b). Estos resultados confirman observaciones previas que asociaron una mayor expresión de IEG con sesgos de disociación y criopreservación9,30, y resaltan la necesidad de controles precisos y experimentos de validación para confirmar los cambios en la expresión génica observados en datos unicelulares.

Finalmente, hay que considerar que los métodos de fijación podrían afectar la detección de genes expresados diferencialmente ya que afectan la complejidad de la biblioteca y el número de genes y UMI. Dado que la capacidad de detectar genes expresados diferencialmente está directamente relacionada con el número de lecturas o UMI asignados a un gen, es posible que se pasen por alto cambios sutiles en la expresión diferencial debido a condiciones biológicas o experimentales. Esperamos que estos efectos sean mayores en las muestras ACME y vivoPHIX, que muestran genes y UMI más bajos detectados por célula (Fig. 2c), aunque esto puede compensarse si se secuencian más células. Las células fijadas con metanol se han utilizado con éxito antes para descubrir cambios en la expresión genética en datos unicelulares en diferentes condiciones biológicas34,35, lo que indica que este método de fijación es adecuado no solo para identificar la expresión genética homeostática sino también para identificar diferencias biológicas más sutiles.

En este trabajo, hemos probado el impacto de los métodos de fijación y preservación en células neuronales y gliales derivadas de hiPSC utilizando algunas réplicas (2 a 4) por condición. Esta cantidad de réplicas es aceptable considerando el costo de los experimentos unicelulares individuales y los estándares experimentales actuales. Sin embargo, limita nuestra capacidad para evaluar plenamente el impacto de todas las variables posibles en la calidad de la muestra. Nuestros resultados muestran que no sólo el método de conservación afecta la composición de la muestra y la expresión genética. Otros parámetros, como los días de conservación, la línea celular utilizada, el experimento de diferenciación y el lote de perlas, tienen un impacto en los transcriptomas unicelulares finales. Sin embargo, este trabajo no proporciona una comparación exhaustiva de todos ellos, lo que está fuera del alcance de este proyecto. Por lo tanto, los resultados proporcionados en este trabajo pueden ser diferentes cuando se trabaja con diferentes tipos de células, muestras y tecnología unicelular o cuando se utilizan condiciones experimentales diferentes a las utilizadas aquí. Los investigadores deben considerar todos estos factores y optimizar los experimentos individuales, dado que nuestros resultados demuestran que el procesamiento de muestras puede afectar significativamente los resultados de los experimentos de transcriptómica unicelular.

Teniendo en cuenta los pros y los contras de los diferentes métodos (Tabla 2) y las limitaciones de este estudio, nuestro análisis comparativo indica que la fijación con metanol es el mejor método de conservación para realizar análisis transcriptómicos unicelulares en células neurales. Las bibliotecas de células fijadas con metanol tienen una complejidad similar a la de las células frescas (Fig. 2) y no presentan fuertes sesgos en la expresión genética que afecten el perfil transcriptómico general de las células (Fig. 5 y 6 y Datos complementarios 4 y 5) o composición celular (Fig. 4 y Fig. complementaria 6), proporcionando así a la muestra el perfil más similar al de las células frescas.

Las hiPSC se mantuvieron en placas recubiertas de matrigel 1:40 (Corning, n.° 354277) en medio mTeSR-1 suplementado (StemCell Technologies, n.° 85850) con 500 U ml-1 de penicilina y 500 mg ml-1 de estreptomicina (Gibco, n.° 15140122). Para la diferenciación de neuronas corticales se siguió el protocolo descrito previamente21 con ligeras modificaciones. Brevemente, se sembraron colonias de hiPSC en placas de 12 pocillos recubiertas con matrigel 1:40 a una densidad celular suficiente para garantizar una confluencia del 100% un día después del recubrimiento. El día 1, el medio se cambió a medio de inducción neural (medio de mantenimiento neural (relación 1:1 de DMEM/F-12 GlutaMAX (Gibco, n.° 10565018) y medio Neurobasal (Gibco, n.° 21103049) con 1× N-2 ( Gibco, #17502048), 1× B-27 (Gibco, #17504044), 5 μg ml-1 de insulina (Sigma, #I9278), l-glutamina 1 mM (Gibco, #35050061), aminoácidos no esenciales 100 μM (Lonza, #BE13-114E), 2-mercaptoetanol 100 μM (Gibco, #31350010), 50 U ml-1 de penicilina y 50 mg ml-1 de estreptomicina) suplementado con 500 ng ml-1 de noggin (R&D Systems, # 3344- NG-050), dorsomorfina 1 μM (tecnologías StemCell, n.° 72102) y SB431542 10 μM (Calbiochem, n.° 616461)). Los medios de inducción neural se reemplazaron todos los días durante 9 a 12 días hasta que se formó la lámina neuroepitelial. En este punto, las células neuroepiteliales se recogieron en agregados usando dispasa (StemCell Technologies, #07923) y se sembraron en una placa de seis pocillos recubierta con laminina (Sigma, #L2020) de 20 μg ml-1 que contenía 2 ml de medio de mantenimiento neural. Las células se incubaron en medio de mantenimiento neural con reemplazo cada dos días hasta que las estructuras de la roseta neural fueron reconocibles (días 12 a 15 después de la inducción neural). Luego, se agregaron 20 ng ml-1 de bFGF (Peprotech, #100-18B) al medio durante 2 a 4 días para promover la expansión de las células madre neurológicas. El día 18 después de la inducción neural, las células se dividieron con dispasa para la amplificación de los precursores. El día 24, cuando las neuronas comienzan a acumularse en el exterior de las rosetas, las células se pasaron 1:3 usando Accutase (Merck Millipore, #SCR005) en una suspensión unicelular y se sembraron a 50.000 células cm-2 en 20 μg ml-. 1 placa de seis pocillos recubierta de laminina. Después de una semana, las células se dividieron nuevamente (proporción 1:4) y se sembraron en placas de seis pocillos recubiertas con laminina de 20 μg ml-1 y continuaron el cultivo durante hasta 50 días (entre 29 y 50) después de la inducción neural con cambios de medio. todos los segundos días. Se utilizaron varias líneas celulares hiPSC y experimentos de diferenciación para la obtención de NPC (Datos complementarios 1). Puede encontrar información adicional sobre los medios y reactivos utilizados en el cultivo celular en los Datos complementarios 7. Todas las líneas celulares hiPSC utilizadas en este trabajo se generaron con el consentimiento informado de donantes humanos. El uso de hiPSC en este trabajo fue aprobado por la Comisión Nacional de Garantías en materia de donación y utilización de células y tejidos humanos del Instituto Nacional de Salud Carlos III.

Las células se disociaron en una suspensión unicelular siguiendo un protocolo previamente descrito optimizado para técnicas de scRNA-seq36. En resumen, las células se disociaron enzimáticamente durante 35 minutos a 37 °C usando tampón de disociación papaína-acutasa (1:1) (kit PDS, Papain, Worthington Biochemical Corporation, #LK003176), y se inactivaron con DMEM/F-12 GlutaMAX suplementado con 10 µM de inhibidor de ROCK (Y-27632, StemCell Technologies, #72304) y 0,033 mg ml-1 de DNasa (DNasa (D2), Worthington Biochemical Corporation, #LK003170). Puede encontrar información adicional sobre los medios y reactivos utilizados en el cultivo celular en los Datos complementarios 7. La suspensión celular se filtró a través de un colador de 40 µm (Pluriselect Life Science, n.º 43-10040-60) y luego se centrifugó a 150 g durante 3 minutos a RT. Después de tres lavados con 0,4 mg ml-1 de BSA en DPBS, se contaron las células y se registró la viabilidad mediante el método del azul tripán. Solo se incluyeron en el estudio muestras con una viabilidad celular superior al 75%.

Alrededor de 2,5 × 106 células después de la disociación se criopreservaron en crioviales en 1 ml de medio de congelación, medio de mantenimiento neural suplementado con 10% v/v de DMSO (Sigma-Aldrich, #D2438) y 20 ng ml-1 de bFGF. Los crioviales se colocaron en un recipiente de congelación Mr. Frosty (Nalgene, #5100-001) previamente lleno con alcohol isopropílico y se almacenaron a -80 °C durante la noche (ON) y luego se transfirieron para un almacenamiento prolongado a un congelador de nitrógeno en fase de vapor. Las muestras criopreservadas de DMSO se descongelaron en un baño de agua a 37 °C en agitación continua, luego se añadió 1 ml de medio de mantenimiento al vial y se transfirió a un tubo Falcon con 10 ml de medio de mantenimiento. Las células se centrifugaron a 160 g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se eliminó cuidadosamente el sobrenadante y el sedimento celular se lavó con 1 ml de DPBS y BSA al 0,01 % y luego se transfirió a un tubo de ADN LoBind de 1,5 ml (Eppendorf, n.º 022431021). Las células se sedimentaron nuevamente y se resuspendieron en DPBS y BSA al 0,01%. Finalmente, las células se filtraron a través de un colador de 40 µm y se contaron en una cámara de Neubauer utilizando el método estándar de azul tripano.

Siguiendo el protocolo de fijación de metanol para RNA-seq unicelular en 10X Genomics (CG000136), se agregaron 200 µl de DPBS helado para resuspender un sedimento de 2,5 × 106 células. Se añadieron gota a gota 800 µl de metanol al 100 % preenfriado hasta que la concentración final de metanol alcanzó el 80 %. Las muestras en tubos de ADN LoBind se colocaron en hielo durante 30 minutos, luego se pusieron a -20 °C y finalmente se transfirieron a -80 °C para un almacenamiento prolongado. Las células fijadas con metanol se descongelaron en hielo y se centrifugaron para eliminar el sobrenadante. El sedimento celular se lavó y se rehidrató en 1 ml de DPBS con BSA al 0,01% y 0,2 U µl-1 de inhibidor de RNasa (Takara Bio, #2313 A) y DTT 1 mM (Sigma-Aldrich, #D0632)) para evitar la degradación del ARN. . Las células se filtraron nuevamente con un colador de 40 µm y se contaron en una cámara de Neubauer.

Se resuspendió suavemente un sedimento de 1 x 106 a 5 x 106 células con 100 µl de tampón de lavado (DPBS con BSA al 0,01% y 0,2 U µl-1 de inhibidor de RNasa y DTT 1 mM). Luego, se añadió gota a gota solución ACME (tampón de lavado: metanol: ácido acético: glicerol; en una proporción final de 13:3:2:2) mientras se mezclaba el tubo hasta un volumen final de 1 ml y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de centrifugar a 1000 ga 4 ° C durante 5 minutos y desechar el sobrenadante, el sedimento celular fijado se lavó dos veces en 1 ml de tampón de lavado y se resuspendió en 1 ml de tampón de lavado suplementado con DMSO al 10% v/v para su almacenamiento a - 80 ºC. Las muestras fijadas con ACME se descongelaron y rehidrataron siguiendo el mismo protocolo que las muestras fijadas con metanol.

Se resuspendió suavemente un sedimento celular que contenía de 1 x 106 a 5 x 106 células con 25 µl de DPBS con BSA al 0,01%. Para la fijación de la muestra, se agregaron 75 µl de reactivo vivoPHIX (Rapid Labs, #RD-VIVO-5) (proporción 3:1) y se mezclaron invirtiendo el tubo 10 veces durante los primeros 5 minutos de fijación. A continuación, el tubo se colocó en un dispositivo de rueda a temperatura ambiente y se incubó durante 30 minutos más. Las muestras se almacenaron a 4 ° C ON y luego se transfirieron a -80 ° C para un almacenamiento prolongado.

Las muestras fijadas con vivoPHIX se rehidrataron añadiendo un volumen (100 µl) de etanol al 100 % y mezclando el tubo varias veces mediante inversión. Luego, las células se sedimentaron a 1000 g durante 5 minutos a temperatura ambiente y se descartó el sobrenadante. Se añadieron muy lentamente 0,5 ml de vivoPHIX-SCAA (1 volumen de vivoPHIX con tres volúmenes de ácido acético glacial) al sedimento celular sin alterarlo y se incubaron durante exactamente 3 minutos a temperatura ambiente. Se eliminó el vivoPHIX-SCAA del sedimento y las células se sedimentaron nuevamente a 100 g durante 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar cualquier líquido restante usando una punta de pipeta P20. El sedimento celular se lavó tres veces con DPBS con BSA al 0,01% y 0,2 U µl-1 de inhibidor de RNasa y DTT 1 mM, y se descartó el sobrenadante. Las células se filtraron con un colador de 40 µm y se contaron en una cámara de Neubauer.

Se resuspendió suavemente un sedimento celular que contenía de 1 x 106 a 5 x 106 células agitando el tubo con el tampón de lavado restante (25 µl) después de la disociación enzimática con una solución de accutasa-papaína. Luego, se agregaron 10 volúmenes de CellCover (250 µl) (Anacyte Laboratories) y la suspensión celular se almacenó a 4 ° o -80 ° C hasta su uso. El protocolo recomendado proporcionado por la empresa no sugiere congelar las muestras ni almacenarlas por un período más largo de 2 a 7 días. Sin embargo, queríamos probar la eficacia de este reactivo en nuestro flujo de trabajo ya que el protocolo es bastante simple. Las muestras fijadas con CellCover se recuperaron siguiendo el mismo procedimiento que para las muestras fijadas con metanol.

Para una encapsulación unicelular en un instrumento NADIA (Dolomite Bio, #3200590), seguimos el protocolo proporcionado por la empresa. Cargamos 75.000 células en un volumen de 250 µl (300.000 células ml-1) y 150.000 perlas Macosko oligodT (ChemGenes Corporation, #Macosko-2011-10 (V+)) en 250 µl (600 perlas µl-1) previamente lavadas y se resuspendió en tampón de lisis (6% p/v Ficoll PM-400, 0,2% v/v Sarkosyl, EDTA 0,02 M, Tris 0,2 M pH 7,5 y DTT 0,05 M en agua libre de nucleasas). Las células y las perlas fluyeron conjuntamente en el chip de microfluidos del dispositivo con una eficiencia de captura del 5 al 7%.

Inmediatamente después de la rotura de la emulsión de gotas, los ARN capturados por el oligodT se transcriben de forma inversa (maxima H RT Master Mix, Thermo, n.º EP0751) (Datos complementarios 8). Luego, el exceso de cebadores de perlas que no capturaron una molécula de ARN se eliminó mediante la incubación de las perlas con Exonucleasa I (New England Biolabs, #174M0293L) durante 45 minutos a 37 °C. Los transcriptomas unicelulares recolectados adheridos a micropartículas (STAMPS) se contaron y resuspendieron en agua libre de nucleasas a 400 perlas µl-1 y se dividieron en grupos de 4000 perlas por tubo de PCR y se amplificaron durante 9 u 11 ciclos de PCR dependiendo del lote de perlas utilizado. para la encapsulación (9 ciclos para el lote 01, 11 para los demás). Después de la purificación del ADNc con perlas AMPure XP 0,6:1 (Agencourt, n.º A63881) para tomar la muestra, se realizó la cuantificación con el ensayo Qubit dsDNA HS (Thermo, n.º Q32851) y la verificación del tamaño de los fragmentos utilizando un sistema 4200 TapeStation (Agilent, n.º G2991BA). . Se utilizó el kit de preparación de biblioteca de ADN Nextera XT (Illumina, n.º FC-131-1096) para etiquetar 600 pg de ADNc, marcar con adaptador Illumina y amplificar (Datos complementarios 8). El tamaño de las bibliotecas de Nextera después de ser purificadas con perlas AMPure XP 0,6:1 para la muestra se determinó utilizando un sistema TapeStation 4200 y se cuantificó con el ensayo Qubit dsDNA HS. Se secuenciaron 1,8 pM de bibliotecas agrupadas en el secuenciador Illumina NextSeq 550 utilizando Nextseq 550 High Output v2. kit (75 ciclos) (Illumina, n.º 20024906) en modo de extremo emparejado; 20 pb para la lectura 1 utilizando el cebador personalizado Read1CustSeqB37 (código de barras de celda y UMI) y 64 pb para la lectura 2 y 8 pb para el índice i7.

Las bibliotecas scRNA-seq se procesaron utilizando el pipeline Drop-seq_tools 2.338 para generar matrices de expresión genética digital (DGE). Primero, se utilizaron herramientas Drop-seq para generar el índice y los archivos de anotación para la versión ensamblada hg38 del genoma humano utilizando la anotación Ensembl versión 10039 como referencia. A continuación, los archivos fastq que contenían lecturas de extremos emparejados se fusionaron en un único archivo BAM no alineado utilizando las herramientas picard v2.18.1440. Utilizando el kit de herramientas Drop-seq con parámetros predeterminados, las lecturas se etiquetaron con la célula y los códigos de barras moleculares, se recortaron en el extremo 5' para eliminar las secuencias del adaptador y en el extremo 3' para eliminar las colas de poliA. A continuación, las lecturas se asignaron al genoma humano (versión hg38) con STAR versión 2.7.0.a41. Los archivos bam resultantes se etiquetaron con los archivos de metadatos de anotación para identificar lecturas de genes superpuestos. Finalmente, la corrección del código de barras de las celdas se realizó mediante los programas DetectBeadSubstitutionError y DetectBeadSynthesisErrors también con parámetros predeterminados. Para estimar el número de celdas obtenidas durante la encapsulación de una sola celda, utilizamos un gráfico de rodilla utilizando como entrada el número de lecturas asignadas de forma única asignadas a los N códigos de barras superiores, donde N es al menos cinco veces el número de celdas esperadas. Luego se utilizó el número estimado de células obtenidas con este procedimiento para generar un DGE. Se generaron dos matrices DGE para cada conjunto de datos, una que contiene todos los UMI que se superponen con los parámetros LOCUS_FUNCTION_LIST = INTRONIC LOCUS_FUNCTION_LIST = INTERGENIC y otra que contiene todos los UMI que se superponen con los parámetros LOCUS_FUNCTION_LIST = null LOCUS_FUNCTION_LIST = INTRONIC.

Las matrices de expresión de DGE se analizaron utilizando Seurat v 4.2.142. Primero, generamos objetos Seurat para cada conjunto de datos y fusionamos estos objetos antes de realizar el filtrado de celdas de baja calidad. Después de la inspección manual, se descartaron todas las células con un recuento de UMI inferior a 200 o superior a 17000, un número de genes inferior a 200 o superior a 5500, un porcentaje de transcripciones mitocondriales superior al 7,5% y un contenido ribosómico superior al 40%. La cantidad de celdas descartadas en cada paso se proporciona en los Datos complementarios 3. Luego, utilizamos DoubletFinder43 en cada objeto de muestra por separado para eliminar los dobletes. Los parámetros y dobletes identificados en cada conjunto de datos se detallan en los Datos complementarios 9. Después de eliminar los dobletes, fusionamos objetos individuales para realizar un análisis conjunto. Inicialmente, se eliminaron todos los genes expresados en menos de tres células. Además, ajustamos un modelo lineal para describir la relación entre el número logarítmico de UMI y el número logarítmico de genes detectados por célula. Se descartaron todas las células con un residuo inferior a -0,5 (3 células). El objeto final de Seurat obtenido contenía 16.870 células y 24.468 genes.

Utilizamos la función de Seurat para hacer una regresión del porcentaje de transcripciones mitocondriales, la cantidad de genes, la cantidad de UMI y el método de preservación. Para normalizar los datos, utilizamos el método LogNormalize y lo multiplicamos por un factor de escala de 10.000. Luego seleccionamos los 2000 genes más variables para calcular 100 componentes principales (PC). Usamos la función ElbowPlot para inspeccionar manualmente la cantidad de variabilidad explicada por cada PC y seleccionar las primeras 20 PC que se usaron para construir el gráfico kNN y calcular el gráfico UMAP usando 500 épocas de entrenamiento (iteraciones). Para eliminar los efectos de lote que afectan la identificación de poblaciones de células compartidas entre conjuntos de datos, utilizamos el paquete Harmony28. Sobre el objeto filtrado y procesado se aplicó la función RunHarmony, proporcionando las muestras como variable a integrar. Al inspeccionar el gráfico Elbow actualizado, seleccionamos las primeras 19 PC corregidas para realizar la agrupación. Utilizamos el paquete clustree44 para inspeccionar los resultados de la agrupación en diferentes resoluciones de 0,1 a 1 y elegimos una resolución final de 0,7 donde obtuvimos poblaciones de 12 células. Para calcular los marcadores superiores para cada grupo, utilizamos la función FindAllMarkers de Seurat con solo marcadores positivos y el resto de parámetros predeterminados. Se seleccionaron marcadores estadísticamente significativos con un valor P ajustado de la prueba de suma de rangos de Wilcoxon inferior a 0,05.

Utilizamos la función AddModuleScore con parámetros predeterminados del paquete Seurat42 para evaluar si los diferentes métodos de fijación inducían estrés o favorecían la apoptosis entre las células. Esta función compara la expresión de un conjunto de genes determinado con conjuntos aleatorios de genes con expresión similar en el conjunto de datos para calcular un enriquecimiento. Para la firma de apoptosis, construimos una firma genética que incluye los genes BCL2, TNF, TP53, CASP3, BAX, CASP8, FAS45. Para la firma del estrés, utilizamos los siguientes genes tempranos inmediatos FOS, JUN, EGR1, UBC, HSPA1B, BTG2, IER2, ID330. Las diferencias estadísticamente significativas en la puntuación de la firma entre los diferentes métodos de fijación y las muestras frescas se calcularon utilizando una prueba de suma de rangos de Wilcoxon de una cola.

Para evaluar los cambios en la composición celular utilizamos scCODA5. Para ejecutar scCODA definimos muestras frescas como condición de referencia. Para establecer la comparación, se tuvo que elegir como referencia un grupo con baja variabilidad entre muestras. En este caso, utilizamos como referencia el cluster NPC, que tenía un buen número de células y una muy baja dispersión (expresada como diferencias entre grupos). Para garantizar que los resultados fueran consistentes y reproducibles, ejecutamos scCODA5 diez veces utilizando el método de muestreo hamiltoniano Monte Carlo con parámetros predeterminados y promediamos los resultados. Los tipos de células con puntuaciones promedio inferiores (o superiores) a cero tienen una disminución (o aumento) significativa en la abundancia según el modelo scCODA (tasa de descubrimiento falso <0,05).

Usamos la función agregadoDatos del paquete R Muscat31 para obtener valores de expresión pseudobulk para cada grupo en cada una de las muestras. Luego, utilizamos la función pbDS para realizar un análisis diferencial de expresión génica utilizando DESeq246 para cada grupo e identificar DEG para cada método en comparación con muestras nuevas. Los DEG con un valor P ajustado de la prueba de Wald <0,05 y un cambio absoluto de log2 veces> 0,58 están disponibles en los Datos complementarios 6 y en la Fig. 6c. Para evaluar si los diferentes métodos de fijación/preservación introdujeron sesgos en la expresión de conjuntos de genes particulares, investigamos los procesos biológicos asociados a genes regulados hacia arriba y hacia abajo utilizando la función enriquecida del paquete GSEApy47. Para este análisis, utilizamos todos los genes que estaban constantemente regulados hacia arriba o hacia abajo en al menos cuatro tipos de células para cada método de fijación/preservación. Sólo se analizaron conjuntos de genes con al menos diez genes. Como conjunto de antecedentes para el análisis de enriquecimiento, proporcionamos todos los genes expresados en el conjunto de datos que tenían al menos 445 UMI, que es la expresión mínima entre los DEG identificados. En todas las comparaciones, no identificamos ningún término de ontología genética significativamente sobrerrepresentado (valor de P ajustado a la prueba hipergeométrica <0,001).

Para evaluar la correlación entre conjuntos de datos, comparamos los perfiles de expresión de todas las células de cada conjunto de datos a nivel global y a nivel de grupo. Para ello, calculamos valores de expresión pseudobulk para todos los genes dentro de un grupo/conjunto de datos específico. Luego, transformamos logarítmicamente los recuentos c usando un pseudorecuento de modo que la expresión normalizada n fuera n = log (c + 1). Usamos estos valores de expresión normalizados para calcular el coeficiente de correlación de Pearson por tipo de célula/muestra usando la función cor en R. Usamos la función pheatmap48 para realizar una agrupación jerárquica usando un método de agrupación completo y usando los coeficientes de correlación para calcular distancias euclidianas entre grupos. Dado que muchos grupos de células son muy similares, repetimos el mismo procedimiento para cada tipo de célula por separado y determinamos la significación estadística de los grupos de muestra utilizando la función shc del paquete sigclust2 R29 en la tabla de correlación correspondiente. El método shc utiliza un procedimiento de prueba de significancia basado en simulación de Monte Carlo para evaluar la importancia de los resultados de agrupamiento jerárquico del conjunto de datos. La significancia estadística se evalúa en cada nodo a lo largo del árbol jerárquico (dendrograma) comenzando desde la raíz usando una prueba de hipótesis nula gaussiana, y se calcula un valor P correspondiente usando el índice de conglomerado de 2 medias, una estadística sensible a las hipótesis nula y alternativa. Se aplica una tasa de error familiar que controla el procedimiento para corregir pruebas múltiples. Generamos gráficos de dendrogramas para cada tipo de célula para ilustrar la similitud entre grupos de diferentes muestras y resaltar las diferencias estadísticamente significativas.

Diferentes lotes de perlas pueden tener diferente eficiencia de captura de ARNm. Para evaluar el impacto del uso de diferentes lotes en encapsulaciones de scRNA-seq, medimos la eficiencia de captura de los lotes de cuentas 01 y 02. Encapsulamos la misma muestra dos veces usando ambos lotes de cuentas utilizados en el papel. Después de la RT-PCR, amplificamos 4000 STAMPS mediante PCR utilizando 9, 10, 11 o 12 ciclos de forma independiente. Después de la purificación de las perlas AMPure XP, el ADNc de cada PCR se cuantificó mediante el ensayo Qubit dsDNA HS. Nuestros resultados demuestran que para obtener una concentración de ADNc similar con los dos lotes de perlas, necesitábamos aumentar en 2 el número de ciclos de PCR cuando usamos el lote 02 (Figura complementaria 2).

Todos los experimentos de transcriptómica unicelular se realizaron utilizando al menos dos líneas celulares diferentes y dos experimentos de diferenciación independientes. Las muestras D1, D2, M3 y M4 provienen de los mismos experimentos de diferenciación, pero se fijaron utilizando diferentes protocolos y en diferentes días (criopreservación con DMSO para D1 y D2, fijación con metanol para M3 y M4). Las muestras F1, F2, M1, M2, D3, A1, A2, V1 y V2 provienen todas de experimentos de diferenciación independientes. Todos los detalles sobre los días de diferenciación, las líneas celulares utilizadas y otros detalles de la preservación de la muestra se pueden encontrar en los Datos complementarios 1. El número inicial de células de cada una de las muestras y el número final después del filtrado de calidad se proporcionan en la Tabla 1. Estos Las celdas son las que se utilizan en todos los análisis proporcionados en el artículo.

La mayoría de los análisis computacionales se han realizado utilizando R49 y paquetes específicos implementados en R 4.2.1 como Seurat50, Harmony28, clustree44, muscat31, sigclust229 y DoubletFinder43. También hemos utilizado el programa scCODA5 implementado en Python para evaluar cambios en la abundancia de tipos de células y el programa GSEApy47 para realizar un análisis de enriquecimiento a término GO. Todos los detalles se proporcionan en la sección Métodos.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos de scRNA-seq sin procesar y procesados generados para este estudio se pueden encontrar en la base de datos GEO con el número de acceso GSE209947. Los datos de origen subyacentes a las Figs. 2c, d, 4b y 6 están disponibles en los archivos de datos complementarios 10-14.

Se ha publicado una corrección a este artículo: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05022-7

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Agradecemos a todos los miembros de Plass Lab por sus útiles comentarios y discusión crítica. También agradecemos a Yvonne Richaud-Patin del Programa de Medicina Regenerativa del IDIBELL y al Dr. Zomeño de la plataforma de Cultivo Avanzado de Células y Tejidos del IDIBELL por su ayuda con el cultivo de células iPSC. Agradecemos al Dr. Iglesias por la revisión crítica del manuscrito. También agradecemos al Dr. Iglesias, al Dr. Kim y al Dr. Sebé-Pedrós por su apoyo en el establecimiento de protocolos ACME y vivoPHIX para la preservación celular. Esta investigación fue financiada por un proyecto de investigación del Programa Estatal de I+D Retos de Investigación del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades de España (Número de subvención: PID2019-108580RA-I00/AEI/10.13039/501100011033). El trabajo de MP cuenta con el apoyo de un contrato Ramón y Cajal del Ministerio de Ciencia e Innovación de España (RYC2018-024564-I). Agradecemos al Programa CERCA/Generalitat de Catalunya el apoyo institucional del IDIBELL.

Estos autores contribuyeron igualmente: Ana Gutiérrez-Franco, Franz Ake.

Regulación genética de la identidad celular, Programa de Medicina Regenerativa, Instituto de Investigaciones Biomédicas de Bellvitge (IDIBELL), L'Hospitalet del Llobregat, Barcelona, España

Ana Gutiérrez-Franco, Franz Ake, Mohamed N. Hassan, Natalie Chaves Cayuela & Mireya Plass

Programa para el avance de la traducción clínica de la medicina regenerativa de Cataluña, P-CMR[C], L'Hospitalet del Llobregat, Barcelona, España

Ana Gutiérrez-Franco, Franz Ake, Mohamed N. Hassan, Natalie Chaves Cayuela, Loris Mularoni & Mireya Plass

Regenerative Medicine Program, Bellvitge Institute for Biomedical Research (IDIBELL), Hospitalet del Llobregat, Barcelona, Spain

Loris Mularoni

Centro de Investigación Biomédica en Red en Bioingeniería, Biomateriales y Nanomedicina (CIBER-BBN), Madrid, España

Lugar Mireya

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AGF y MP diseñaron el proyecto y planificaron experimentos. AGF y NC realizaron trabajos experimentales. FA, MH y MP realizaron análisis de datos computacionales. LM realizó el análisis compositivo de las muestras. MP obtuvo financiamiento, supervisó y coordinó el trabajo. AGF, FA y MP interpretaron los resultados. MP escribió el manuscrito con aportaciones de todos los autores.

Correspondencia a Mireya Plass.

MP es miembro del consejo editorial de Communications Biology, pero no participó en la revisión editorial ni en la decisión de publicar este artículo. Los demás autores no declaran tener intereses en conflicto.

Communications Biology agradece a Timothy (J) Petros y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal: George Inglis. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Gutiérrez-Franco, A., Ake, F., Hassan, MN et al. La fijación de metanol es el método de elección para la transcriptómica unicelular de células neurales basada en gotas. Común Biol 6, 522 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04834-x

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Recibido: 05 de agosto de 2022

Aceptado: 12 de abril de 2023

Publicado: 15 de mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04834-x

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