Análisis metabolómico de la leishmaniasis visceral a partir de orina de hámster dorado.

Parásitos y vectores volumen 16, número de artículo: 304 (2023) Citar este artículo

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La leishmaniasis es una de las enfermedades tropicales más desatendidas y se propaga principalmente en regiones empobrecidas del mundo. Aunque muchos estudios se han centrado en la respuesta del huésped a la invasión de Leishmania, se sabe relativamente menos sobre los complejos procesos a nivel metabólico, especialmente las alteraciones metabólicas en los huéspedes infectados.

En este estudio, realizamos análisis metabolómicos en la orina de hámsteres dorados en presencia o ausencia de leishmaniasis visceral (LV) utilizando el espectrómetro de masas de alta resolución (HRMS) en tándem del sistema de cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC). Las características metabólicas de las muestras de orina, junto con el cambio histopatológico y la carga parasitaria de los tejidos del hígado y el bazo, se detectaron a las 4 y 12 semanas después de la infección (WPI), respectivamente.

El metabolismo de los aminoácidos se vio ampliamente afectado en ambas etapas de la progresión de la LV. Mientras tanto, también hubo distintas características metabólicas en diferentes etapas. A las 4 WPI, las vías metabólicas significativamente afectadas involucraron el metabolismo de alanina, aspartato y glutamato, la vía de las pentosas fosfato (PPP), el metabolismo de la histidina, el metabolismo del triptófano y el metabolismo de la tirosina. A las 12 WPI, las vías metabólicas notablemente enriquecidas estaban casi concentradas en el metabolismo de los aminoácidos, incluido el metabolismo de la tirosina, el metabolismo de la taurina e hipotaurina y el metabolismo del triptófano. Los metabolitos y las vías metabólicas desreguladas en 12 WPI fueron obviamente menores que los de 4 WPI. Además, se evaluaron siete metabolitos que estaban desregulados en ambas etapas mediante análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) y pruebas de características operativas del receptor (ROC) para determinar si tenían potencial de diagnóstico. La combinación de estos metabolitos como panel de biomarcadores potenciales mostró un rendimiento satisfactorio para distinguir los grupos de infección de los grupos de control, así como entre las diferentes etapas de la infección.

Nuestros hallazgos podrían proporcionar información valiosa para una mayor comprensión de la respuesta del huésped a la infección por Leishmania desde el aspecto del metaboloma de la orina. El panel de biomarcadores de orina propuesto podría ayudar en el desarrollo de un enfoque novedoso para el diagnóstico y pronóstico de la LV.

Causada por más de 20 especies de parásitos del género Leishmania, la parasitosis leishmaniasis transmitida por flebótomos, una de las enfermedades tropicales más desatendidas, se propaga en aproximadamente 97 países en todo el mundo [1]. Se estima que cada año se notifican entre 0,7 y 1 millón de nuevos casos de leishmaniasis [2]. Las manifestaciones de la leishmaniasis incluyen principalmente LV, leishmaniasis cutánea (CL) y leishmaniasis mucocutánea (MCL). La LV es la forma más grave y puede ser mortal si no se trata a tiempo. En los últimos años, los casos de LV se concentraron en África Oriental, el subcontinente indio y Brasil, y el 83% de estos casos se notificaron en Brasil, Etiopía, India, Sudán del Sur y Sudán [1, 3]. En China, se ha reconocido que la LV es la única forma autóctona de leishmaniasis, distribuida principalmente de forma esporádica en áreas locales de las provincias de Xinjiang, Gansu y Sichuan, y el área endémica se está expandiendo gradualmente [4]. A través de la discriminación previa y el análisis filogenético, se ha confirmado que Leishmania donovani y L. infantum son los principales agentes causantes de la LV china [5, 6].

No cabe duda de que el diagnóstico precoz es crucial para la investigación epidemiológica y el control de la leishmaniasis, así como para su tratamiento. Además, teniendo en cuenta la gran diversidad de reservorios en los focos epidémicos naturales y la compleja movilidad de la población, un método ideal de detección/diagnóstico debe ser simple, rápido y adecuado para una detección de alto rendimiento. Se han estudiado métodos de examen de laboratorio para la LV, incluidas pruebas serológicas, ensayos inmunológicos y métodos basados en PCR. Algunos de ellos, como la varilla medidora rK39, se han aplicado comercialmente. Debido a la sensibilidad y especificidad, actualmente no existe ningún otro método que pueda realizar el diagnóstico final de LV que las biopsias invasivas de bazo, hígado, médula ósea y ganglios linfáticos. En particular, la aspiración esplénica sigue siendo el estándar de oro actual [7]. Estos métodos invasivos que ponen en peligro la vida requieren habilidades operativas relativamente altas y, por lo tanto, no son adecuados para la popularización o investigación de campo a gran escala [8]. Por tanto, sigue siendo necesario el desarrollo de un nuevo método de diagnóstico rápido y eficaz. Para el tratamiento, el antimonial pentavalente (SbV), la anfotericina B y la miltefosina se han utilizado durante mucho tiempo para el tratamiento de la LV. Los desafíos cada vez mayores de la resistencia a los medicamentos, las reacciones adversas y la toxicidad han socavado la eficacia de la quimioterapia para la LV [9]. Existe una necesidad urgente de desarrollar nuevos medicamentos específicos para mejorar la situación actual. En resumen, las mejoras en el diagnóstico o la farmacoterapia de la LV dependen esencialmente de un conocimiento integral de los mecanismos que subyacen a la leishmaniasis.

Con estudios extensos, se ha obtenido un conocimiento más completo sobre los mecanismos moleculares de la patogénesis de la leishmaniasis [10, 11]. En los últimos años se han realizado algunos descubrimientos en el metabolismo molecular de Leishmania con la introducción de enfoques metabolómicos. Se han descrito las características metabólicas de diferentes etapas o diferentes especies de Leishmania [12,13,14], y se ha descubierto que el perfil metabolómico de las células huésped se ve afectado durante la infección por Leishmania [15,16,17]. Además, se han informado desviaciones en el metaboloma inducido por fármacos (SbV o miltefosina) [18, 19], así como análisis metabolómicos del mecanismo de resistencia a los medicamentos en Leishmania [20,21,22]. Estos estudios han ampliado nuestro conocimiento actual sobre la respuesta del huésped a la invasión de Leishmania. Por otro lado, a través de análisis estadísticos comparativos de conjuntos de datos adquiridos, los métodos metabolómicos basados en espectrometría de masas tienen ventajas únicas en la búsqueda de indicadores para ciertos estados, lo que ha sido bien demostrado y aplicado por estudios que buscan biomarcadores de una variedad de enfermedades [23]. Para la leishmaniasis, se han seleccionado y evaluado algunos metabolitos que fueron predictivos y pronósticos para el tratamiento de la leishmaniasis [24]. Además, nuestro estudio reciente exploró los cambios metabólicos en el suero durante una serie de cuatro puntos temporales de VL. Las vías metabólicas relacionadas con los glicerofosfolípidos (GPL) se vieron afectadas significativamente, en las que la fosfatidilcolina (PC) y la fosfatidiletanolamina (PE) aumentaron durante la VL [25]. En general, al investigar directamente los cambios en las moléculas pequeñas durante la infección, los enfoques metabolómicos proporcionan un medio prometedor para comprender mejor la interacción huésped-Leishmania y descubrir nuevos objetivos para el diagnóstico y pronóstico de la leishmaniasis. Sin embargo, la comprensión actual de la interacción huésped-Leishmania desde los aspectos metabólicos aún es insuficiente [26].

Dado que la orina es el tipo de muestra que contiene la mayoría de los productos metabólicos finales, los cambios en la orina tienen la capacidad de reflejar la alteración de muchas vías bioquímicas del cuerpo [27, 28]. Además, debido a su fácil disponibilidad y menor complejidad de componentes que otras muestras biológicas, la orina es un tipo de muestra ideal para estudios y pruebas [29]. En el campo de investigación de Leishmania, el hámster dorado sirio (Mesocricetus auratus) es muy susceptible a la infección y puede simular bien la progresión de la LV; por lo tanto, se considera el mejor modelo experimental para el estudio patológico [30]. En este estudio, realizamos análisis metabolómicos en la orina de hámsteres dorados en presencia o ausencia de VL basado en el espectrómetro de masas de alta resolución (HRMS) en tándem del sistema de cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC), y se utilizaron métodos estadísticos univariados y multivariados. Se utiliza para analizar el conjunto de datos adquiridos tanto en las etapas tempranas como tardías de VL. Los hallazgos sobre las características del metaboloma podrían facilitar nuestra comprensión de la respuesta del huésped a la progresión de la LV. Además, se espera que el biomarcador potencial seleccionado contribuya al desarrollo de nuevas técnicas de diagnóstico y seguimiento del proceso de LV.

Los experimentos con animales en este estudio fueron permitidos por y bajo la supervisión del Comité de Ética Médica del Departamento de Gestión Médica de la Universidad de Sichuan. En el caso de operaciones que pudieran causar dolor en los animales, se administró anestesia por inhalación de éter antes de otros procesos. La Certificación de Ética para experimentos con animales y su versión traducida se proporcionan en los Materiales complementarios.

La cepa de Leishmania utilizada en este estudio fue identificada como L. infantum en un estudio anterior [25]. La cepa se conservaba habitualmente en hámsteres. Antes de los experimentos, la cepa de Leishmania se aisló y se cultivó en medio líquido M199 modificado (que contiene 15% de suero bovino fetal y 20% de sangre de conejo desfibrinada estéril) herméticamente a 26 °C con agitación a 80 rpm. Los promastigotes metacíclicos se concentraron y resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) de pH 7,4 preparada para la infección animal.

Un total de 24 hámsteres dorados (M. auratus) hembras de 2 meses de edad se dividieron aleatoriamente en grupos de control e infección (n = 12 para cada grupo). Todos los hámsteres fueron criados en una sala de animales de laboratorio y se les proporcionó agua y alimento estéril ad libitum. Antes de los experimentos formales, se realizaron 4 semanas de reproducción para atenuar las respuestas al estrés.

De manera similar a nuestro modelo previamente establecido, los hámsteres agrupados fueron sometidos a inoculación. Después del recuento, se inyectó por vía intraperitoneal 1 ml de inóculo de PBS que contenía 2,7 × 107 promastigotes de L. infantum en cada hámster del grupo de infección [25]. Para el grupo de control, los hámsteres se sometieron por separado a 1 ml de PBS únicamente.

Tanto a los 4 como a los 12 WPI, se recolectaron ocho muestras de orina en cada grupo para la detección de metabolómica. Para eliminar los errores causados por el ritmo circadiano de los mamíferos [31], el muestreo se inició a la misma hora del día y se realizó durante 6 h a través de jaulas metabólicas. Antes de la recolección, se les proporcionó ayuno nocturno y agua potable adecuada. Las muestras de orina se almacenaron inmediatamente a –80 °C hasta la detección metabolómica.

En cada grupo, los otros cuatro hámsteres fueron sacrificados para confirmar la infección y observar patológicamente. Se sacrificaron dos hámsteres del grupo de infección o de control a los 4 y 12 WPI, respectivamente. Los tejidos del hígado y el bazo se recogieron y se fijaron en paraform al 10% (Solarbio, Beijing, China) durante 4 semanas, seguido de un procedimiento de sustitución gradual de agua por etanol en los tejidos fijados. Luego, el xileno se sustituyó gradualmente por etanol y finalmente las secciones se saturaron adecuadamente con parafina líquida. Finalmente, se tiñeron cortes de tejido de 3 μm con reactivo de hematoxilina-eosina (H&E) (Solarbio, Beijing, China). La progresión de la infección se evaluó mediante examen microscópico.

Paralelamente, se pesaron los tejidos del hígado y del bazo y se homogeneizaron 50 mg de cada muestra en 1 ml de PBS. Luego, se extrajo el ADN total utilizando el kit de ADN genómico TIANamp (TianGen Biotech, Beijing, China) según el manual. Para cada muestra, el ADN extraído se diluyó en 80 µl de ddH2O libre de RNasa. Para la curva estándar de carga de Leishmania, los parásitos se diluyeron en un gradiente de diez veces de 106 a 1. El ADN total se extrajo y se almacenó en 80 µl de ddH2O libre de ARNasa. Se realizó un esquema de PCR en tiempo real de fluorescencia con sonda TaqMan para detectar la carga parasitaria. El par de cebadores y la sonda se describieron en investigaciones anteriores [32]. Las condiciones de la PCR se enumeran en el archivo adicional 1: Tabla S1. Los programas de PCR se ejecutaron en Mastercycler ep realplex 2 (Eppendorf, Alemania).

La detección metabolómica de muestras de orina se realizó en el laboratorio del Instituto de Genómica de Beijing (BGI) con base en la plataforma del sistema de cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) 2D de Waters en tándem ThermoFisher Q Exactive espectrómetro de masas de alta resolución (HRMS).

El proceso detallado de pretratamiento de la muestra y los componentes de los estándares internos se proporcionan en el archivo adicional 2. La separación cromatográfica se realizó en una columna BEH C18 (1,7 μm, 2,1 × 100 mm, Waters, EE. UU.). La fase móvil del modo de ionización por electropulverización positiva (ESI+) consistió en la solución A (agua que contiene 0,1% de ácido fórmico) y la solución B (metanol que contiene 0,1% de ácido fórmico). La fase móvil del modo de ionización por electropulverización negativa (ESI-) consistía en la solución A (agua que contiene formiato de amonio 10 mM) y la solución B (etanol al 95% que contiene formiato de amonio 10 mM). El procedimiento de elución en gradiente fue el siguiente: 0–1 min, solución B al 2%; 1–9 min, solución B al 2–98%; 9 a 12 min, solución B al 98%; 12–12,1 min, solución B al 98–2%; 12,1–15 min, solución B al 2 %. La velocidad del flujo fue de 0,35 ml/min, la temperatura de la columna fue de 45 °C y el volumen de carga de la muestra fue de 5 μl.

Los datos de MS y MS2 se obtuvieron con relaciones masa/núcleo de escaneo que oscilaron entre 70 y 1050. Los tiempos de inyección del escaneo primario y secundario fueron de 100 y 50 ms, respectivamente. El NCE escalonado fue de 20, 40 y 60 eV. El caudal de gas envolvente de ESI fue 40 y el caudal de gas auxiliar fue 10. El voltaje de pulverización fue 3,80 para ESI+ y 3,20 para ESI-. La temperatura del capilar fue de 320 °C y la temperatura del calentador de gas auxiliar fue de 350 °C.

Los datos sin procesar se importaron principalmente a Compound Discoverer 3.1 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) para su preprocesamiento. Se llevaron a cabo la selección, alineación y extracción de picos, corrección del tiempo de retención, fusión de iones de aducción, llenado de valores faltantes, marcado de picos de fondo, normalización, deconvolución e identificación. Después del preprocesamiento, los datos originales se transfirieron al paquete de software metaX [33] basado en R para realizar análisis metabolómicos, análisis estadísticos y anotaciones de metabolitos. Después de la normalización del cociente probabilístico (PQN) y la corrección robusta de la señal LOESS basada en el control de calidad (QC-RLSC), los picos de iones con un coeficiente de variación (CV) en muestras de control de calidad > 30 % se eliminaron de los análisis posteriores. Luego, los iones detectados se identificaron comparándolos con sustancias estándar y combinando referencias de bases de datos de creación propia, bases de datos comerciales y bibliotecas de acceso abierto, incluidas la biblioteca BGI, la biblioteca de espectros de masas mzCloud, Chemspider, la base de datos del metaboloma humano (HMDB), Kioto. Enciclopedia de genes y genomas (KEGG) y mapas de lípidos.

Después de la identificación de los iones, los datos pretratados se sometieron a análisis estadísticos estándar. Antes de los análisis estadísticos univariados y multivariados, los datos originales se normalizaron mediante conversión log2 y escala de Pareto. Luego se empleó el análisis de componentes principales (PCA) para observar similitudes y diferencias dentro y entre los grupos de muestra y evaluar los valores atípicos. Se realizaron la prueba t de Student, el cálculo del cambio de veces (FC) y PLS-DA para identificar iones diferenciales entre los grupos de infección y control. Al calcular los valores de FC, los valores P ajustados de la tasa de descubrimiento falso (FDR) y la importancia variable para la proyección (VIP), los metabolitos que satisfacen FC ≥ 1,2 o ≤ 0,8333, P <0,05 y VIP ≥ 1,0 simultáneamente se reconocieron como metabolitos diferenciales.

Para maximizar la precisión de los resultados, en los análisis de este estudio solo se seleccionaron y utilizaron iones cuyos datos de MS2 coincidieran completamente con las bibliotecas. Los metabolitos se clasificaron según la información de su categoría en HMDB. Los análisis de vías se realizaron utilizando MetaboAnalyst 5.0 [34]. Se evaluó el desempeño de potenciales biomarcadores para el diagnóstico de leishmaniasis visceral mediante la prueba ROC. Cuanto más cerca estuviera el área bajo la curva (AUC) de 1,0, mejor sería la eficacia del diagnóstico predictivo.

Después de la infección, no hubo diferencias significativas en el comportamiento de los hámsteres entre los grupos de control y de infección en el 4 WPI. A las 12 WPI, se observaron hipersomnia y actividad reducida en los hámsteres del grupo infectado.

La microscopía de los cortes de tejido reveló la progresión de la LV en el grupo de infección en comparación con el grupo de control (Figs. 1, 2). A las 4 WPI, se observó una infiltración obvia de células inflamatorias en cortes de hígado, mientras que los cambios en el bazo fueron discretos. Cuando la VL progresó a 12 WPI, comenzaron a aparecer granulomas esporádicos en los cortes de hígado. En el bazo se observó pulpa blanca expandida, dentro de la cual se encontraron amastigotes difusos. El estado de la infección también se determinó mediante PCR en tiempo real (la curva estándar de PCR en tiempo real se muestra en el archivo adicional 3: Fig. S1), en la que la carga de parásitos mostró una tendencia creciente de 4 a 12 WPI (Fig. 3). lo cual es generalmente consistente con los resultados patológicos. Estos resultados también fueron consistentes con nuestro estudio anterior [25], que demostró que las características patológicas del modelo animal VL eran estables y repetitivas.

Cortes patológicos de tejido hepático teñidos con H&E. A Secciones de tejido observadas con un aumento de 400 ×. B Secciones de tejido observadas con un aumento de 1000 ×. Los gráficos en cada columna de izquierda a derecha representan grupos de control, 4 y 12 WPI, respectivamente, como se marca en la parte superior. A diferencia del grupo de control, la infiltración de células inflamatorias se observó a las 4 WPI. Se observaron granulomas esporádicos importantes a las 12 WPI, indicados por pentágonos amarillos. Los amastigotes de Leishmania se indicaron con flechas amarillas. Barra: (A) 60 µm; (B) 24 µm

Cortes patológicos de tejidos del bazo teñidos con H&E. A Secciones de tejido del bazo con un aumento de 400 ×. B Secciones de tejido del bazo con un aumento de 1000 ×. Los gráficos en cada columna de izquierda a derecha representan grupos de control, 4 y 12 WPI, respectivamente, como se marca en la parte superior de los gráficos. A diferencia del grupo de control, los cambios no fueron tan obvios, aunque se reconoció una tendencia a la agregación de macrófagos. Las manchas similares a amastigotes de Leishmania eran obvias en la pulpa blanca expandida a 12 WPI, indicadas por flechas amarillas. Barra: (A) 60 µm; (B) 24 µm

Carga parasitaria en hígado y bazo. Carga de Leishmania en el hígado y el bazo a 4 y 12 WPI, respectivamente (se mataron 2 hámsteres del grupo de infección o de control en cada momento y cada muestra se realizó por triplicado)

Los cromatogramas de picos básicos (BPC) de las muestras de control de calidad estaban muy superpuestos y los gráficos de PCA de las muestras de control de calidad estaban muy concentrados. Estos resultados demostraron la repetibilidad y estabilidad del sistema LC-MS durante el período de prueba (archivo adicional 4: Fig. S2).

A las 4 o 12 WPI, ocho muestras de orina del grupo de infección o de control, respectivamente, se sometieron a análisis de metabolitos. Después del preprocesamiento de los datos sin procesar, la filtración de datos y la anotación de metabolitos, se identificaron un total de 18 201 iones, de los cuales 11 038 estaban en modo ESI+ y 7163 estaban en modo ESI- (Tabla 1A). Estos iones cubrieron los niveles de confianza de identificación del nivel 1 al 5 [35]. En este estudio, para garantizar la exactitud y precisión de los resultados, solo se seleccionaron para análisis e interpretaciones metabolómicas los metabolitos que se interpretaron a través de bibliotecas MS2. Dado que PCA no puede discriminar ni el grupo de infección del grupo de control ni el grupo de infección en diferentes momentos (archivo adicional 4: Fig. S2B), se empleó PLS-DA supervisado para identificar mejor los diferentes metabolitos entre los diferentes grupos (Fig. 4 en modo ESI+ y archivo adicional 5: Fig. S3 en modo ESI−). La Figura 4A, B muestra que los grupos de infección se separaron significativamente de los grupos de control en 4 WPI y 12 WPI, y los grupos de infección de 4 y 12 WPI también se dividieron en la Fig. 4C. Para la figura 4A, R2 = 0,99, Q2 = 0,82; para la figura 4B, R2 = 0,99, Q2 = 0,58; para la figura 4C, R2 = 0,99, Q2 = 0,60.

Gráficos PLS-DA de comparación entre diferentes grupos en modo ESI+. En el gráfico PLS-DA, cada punto de datos representa una muestra de orina. Los resultados se calcularon mediante el paquete metaX basado en R. A Control versus infección a 4 WPI. R2 = 0,99, Q2 = 0,82. B Control versus infección a 12 WPI. R2 = 0,99, Q2 = 0,58. C 4 WPI frente a 12 WPI del grupo de infección. R2 = 0,99, Q2 = 0,60

Como muestra la Tabla 1B, siguiendo los criterios preestablecidos de FC ≥ 1,2 o ≤ 0,8333, FDR ajustado p < 0,05 y VIP ≥ 1,0, en 4 WPI, hubo 90 metabolitos diferenciales entre los grupos de infección y control, de los cuales 57 estaban en ESI + modo y 33 estaban en modo ESI-. A las 12 WPI, se identificaron 47 metabolitos diferenciales en modo ESI + y 18 metabolitos diferenciales en modo ESI-. La información detallada de los metabolitos diferenciales totales se enumera en el archivo adicional 6. En particular, 12 metabolitos variaron tanto en 4 como en 12 WPI (Fig. 5A, B), de los cuales 11 estaban en modo ESI + y el otro en modo ESI-.

Recuento y distribución de metabolitos diferenciales a 4 WPI y 12 WPI. Los metabolitos diferenciales totales en diferentes momentos se visualizaron como un diagrama de Venn basado en línea "Venny 2.1". A Resultados en modo ESI+. Se compartieron once metabolitos a 4 WPI y 12 WPI. B Resultados en modo ESI−. Se compartió un metabolito a 4 WPI y 12 WPI

Los metabolitos diferenciales se clasificaron según sus características estructurales. La nomenclatura se refería a HMDB. En total, se identificaron nueve subclases diferentes de compuestos, incluidos ácidos orgánicos y derivados, compuestos organoheterocíclicos, compuestos orgánicos de oxígeno, bencenoides, lípidos y moléculas similares a lípidos, fenilpropanoides y policétidos, compuestos orgánicos de nitrógeno, péptidos, nucleósidos, nucleótidos y análogos, y otros metabolitos no clasificados. Al contar los diferentes perfiles de los números de estos metabolitos diferenciales, se revelaron entre 4 y 12 WPI (Fig. 6). Los ácidos orgánicos y sus derivados predominaron a las 4 WPI, seguidos de los compuestos organoheterocíclicos y los compuestos orgánicos de oxígeno. A las 12 WPI, los recuentos de estos tres tipos de compuestos disminuyeron, mientras que los lípidos y las moléculas similares a los lípidos aumentaron.

Categorías y recuento de metabolitos diferenciales a 4 WPI y 12 WPI. Los metabolitos diferenciales se clasificaron según sus características estructurales y las categorías de metabolitos según HMDB. Las barras azules representan 4 WPI y las barras verdes 12 WPI

Los metabolitos diferenciales se agruparon jerárquicamente de acuerdo con sus patrones de cambio y luego se visualizaron como mapas de calor (Fig. 7 en modo ESI + y archivo adicional 7: Fig. S4 en modo ESI-). En 4 WPI, 61 metabolitos diferenciales estaban regulados positivamente, mientras que 29 estaban regulados negativamente, en los cuales casi todos los ácidos y derivados orgánicos y los compuestos orgánicos de oxígeno estaban regulados positivamente. A las 12 WPI, 29 metabolitos diferenciales estaban regulados positivamente, mientras que 36 estaban regulados negativamente, en los cuales los ácidos orgánicos y sus derivados tendían a estar regulados positivamente, mientras que los lípidos y las moléculas similares a los lípidos estaban regulados negativamente.

Mapas de calor de metabolitos diferenciales a 4 WPI y 12 WPI en modo ESI +. Los metabolitos diferenciales se agruparon jerárquicamente según sus patrones de cambio y luego se visualizaron como mapas de calor. A Resultados a 4 WPI en modo ESI+. B Resultados a 12 WPI en modo ESI+. Las barras rojas en la parte superior de cada mapa indican el grupo de control y las barras verdes el grupo de infección. Los metabolitos están representados por filas. Los colores marrón rojizo y azul indican el aumento y la reducción de la intensidad del metabolito, respectivamente.

Estos resultados revelaron que el perfil metabólico del grupo de infección, incluidas las especies, números e intensidades de los metabolitos diferenciales, cambió significativamente a las 4 y 12 WPI.

Los resultados del análisis de la vía se muestran en la Fig. 8. En 4 WPI, las vías metabólicas significativamente afectadas contenían principalmente el metabolismo de alanina, aspartato y glutamato, la vía de las pentosas fosfato, el metabolismo de glioxilato y dicarboxilato, el metabolismo de purina, el metabolismo de histidina, el metabolismo de triptófano y la tirosina. metabolismo. A las 12 WPI, el número de vías metabólicas desreguladas fue menor que a las 4 WPI. El metabolismo de la tirosina, el metabolismo de la taurina e hipotaurina y el metabolismo del triptófano fueron las vías metabólicas marcadamente afectadas. La información sobre los metabolitos diferenciales involucrados en algunas vías desreguladas se muestra en la Tabla 2. La información detallada sobre el estado coincidente de cada vía desregulada se incluye en el archivo adicional 8.

Vías desreguladas a 4 WPI y 12 WPI. El análisis de la ruta se realizó utilizando MetaboAnalyst 5.0. Cuanto más intenso sea el color, menor será el valor p. Cuanto mayor sea el tamaño de la burbuja, mayor será el impacto en la vía. A Vías desreguladas a 4 WPI. B Vías desreguladas a 12 WPI

A través de análisis univariados y multivariados, 12 metabolitos variaron tanto a 4 como a 12 WPI y fueron seleccionados como biomarcadores alternativos para su posterior evaluación. Mediante pruebas ROC univariadas adicionales, 7 de los 12 metabolitos tuvieron un AUROC > 0,8 (Tabla 3), lo que mostró un rendimiento relativamente satisfactorio para distinguir entre el grupo de infección y el grupo de control. Por lo tanto, los siete metabolitos fueron designados como un posible panel de biomarcadores que se analizará para el diagnóstico de LV.

Luego se evaluaron la especificidad y sensibilidad del panel de biomarcadores en la detección de VL mediante análisis de curva ROC. Para identificar el grupo de infección a 4 o 12 WPI, la sensibilidad y especificidad fueron muy altas, ya que los AUROC fueron casi 1 (Fig. 9A, B). Además, el rendimiento del panel de biomarcadores también fue satisfactorio para distinguir grupos de infección entre 4 y 12 WPI, ya que el AUROC fue 0,989 con un intervalo de confianza del 95 % de 0,831 a 1 (Fig. 9C). Estos resultados sugirieron que el panel de biomarcadores seleccionado tiene potencial para el diagnóstico y el seguimiento del curso de la LV. Los mapas de calor en la Fig. 9D mostraron los cambios en la fuerza iónica de los siete biomarcadores potenciales a 4 WPI y 12 WPI.

Mapas de calor y curva ROC para evaluar el potencial diagnóstico del panel de biomarcadores seleccionado. Cuanto más cerca estuviera el AUC de 1,0, mejor sería la eficacia del diagnóstico predictivo. Una curva ROC del panel de biomarcadores a 4 WPI. B Curva ROC del panel de biomarcadores a 12 WPI. Curva C ROC del panel de biomarcadores para 4 WPI frente a 12 WPI. D Los cambios de fuerza iónica de los siete biomarcadores potenciales a 4 WPI y 12 WPI se visualizaron como mapas de calor. Cada fila en los mapas de calor a 4 WPI y 12 WPI correspondía al mismo ID y nombre del compuesto a la derecha

De acuerdo con los resultados categorizados de metabolitos diferenciales y mapas de calor (Figs. 6, 7), encontramos que los ácidos orgánicos y sus derivados representaron una porción significativa de los metabolitos diferenciales, especialmente casi todos los ácidos y derivados orgánicos y los compuestos orgánicos de oxígeno que fueron regulados al alza a 4 WPI. Mientras tanto, los análisis de enriquecimiento de las vías metabólicas mostraron que algunas vías metabólicas de aminoácidos se vieron afectadas de manera más significativa a 4 WPI y 12 WPI, incluido el metabolismo de alanina, aspartato y glutamato, taurina e hipotaurina, triptófano y tirosina. Esto reflejó que había una anomalía notable en el metabolismo de los aminoácidos de los hámsteres infectados. Según nuestra investigación previa sobre modelos de hámster de Leishmania [25], 4 WPI era todavía una etapa relativamente temprana de todo el período infeccioso, momento en el que los parásitos proliferaron rápidamente. Leishmania tiene una enorme demanda de energía durante el período de crecimiento inicial y los aminoácidos son una importante fuente de carbono para Leishmania. Aunque Leishmania puede sintetizar algunos aminoácidos de novo, muchos de ellos son auxotróficos [36] y deben obtenerse del entorno del huésped. Esta podría ser la causa del trastorno del metabolismo de los aminoácidos en el huésped. El metabolismo de los aminoácidos ocurre principalmente en el hígado y, en este estudio, existió enriquecimiento de parásitos en el hígado a 4 WPI según los resultados de las secciones patológicas y la PCR en tiempo real. Combinado con nuestro reciente estudio sobre la metabolómica sérica [25], encontramos que el enriquecimiento de Leishmania en el hígado en una etapa temprana puede causar daño al hígado y alterar claramente el metabolismo energético del huésped, particularmente el metabolismo de lípidos y aminoácidos.

El número de metabolitos diferenciales identificados y el análisis de vías mostraron que la alteración del metabolismo a 12 WPI obviamente disminuyó en comparación con la de 4 WPI (Tabla 1; Fig. 8). En nuestro modelo de hámster dorado VL, en comparación con 4 WPI, 12 WPI es el período medio a tardío, momento en el cual se pudieron observar más amastigotes y granulomas en los órganos viscerales (Figs. 1, 2). Existe evidencia de que el crecimiento de amastigotes en el microambiente del granuloma está muy limitado [37]. El aumento de la carga parasitaria en la etapa tardía generalmente se estabiliza según la investigación de otros modelos de ratón VL [38, 39]. Muchos amastigotes semiinactivos se encuentran en un estado metabólico estricto y distintivo con una disminución global en los procesos de consumo de energía [14, 37, 40]. Por lo tanto, especulamos que la reducción de la alteración metabólica de la orina a las 12 WPI puede estar relacionada con un estado de crecimiento lento de Leishmania en un entorno de lesión en el período medio o tardío.

En este estudio, el metabolismo de la alanina, el aspartato y el glutamato fueron las vías metabólicas significativamente afectadas a 4 WPI. Está bien establecido que, junto con la alanina y el aspartato, el glutamato participa directamente en el suministro de intermediarios al ciclo de Krebs [41]. También participó en el proceso de diferenciación de epimastigotes a tripomastigotes metacíclicos de Trypanosoma cruzi [42]. Entre los metabolitos involucrados en esta vía, la l-glutamina y la d-glucosamina 6-fosfato aumentaron a 4 WPI según el cálculo de la fuerza iónica (Tabla 2). Se ha demostrado que los amastigotes de Leishmania dependen en gran medida del metabolismo mitocondrial para la síntesis de novo de glutamato y glutamina [14]. Además, la investigación ha demostrado que la glutamina puede potenciar la eliminación del parásito mediante el desarrollo de una respuesta inmune adaptativa anti-Leishmania más efectiva, y también demostró una regulación positiva de los genes asociados con la glutaminolisis, así como un aumento en el consumo de glutamina de Leishmania donovani. macrófagos infectados [43]. Por lo tanto, la regulación positiva del contenido de glutamina en la orina probablemente esté relacionada con la demanda común de nutrientes de las células inmunes y de supervivencia de Leishmania, así como con la potenciación de la respuesta inmune del huésped en la etapa infectiva anterior. La d-glucosamina 6-fosfato es el metabolito intermedio de la glutamina para la biosíntesis de hexosaminas. Se ha informado que la biosíntesis de hexosaminas, como la N-acetilglucosamina, fue esencial para el crecimiento y la virulencia de Leishmania [44], mientras que en este estudio no se detectaron hexosaminas en las muestras de orina; Quizás sea necesario el análisis metabólico de otras muestras biológicas. En 4 WPI, la PPP también es una vía afectada. La PPP es una vía clave en los tripanosomátidos, que genera principalmente nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) como fuente de poder reductor y otros productos que alimentan diversas partes del metabolismo [45]. Los metabolitos diferenciales involucrados en esta vía incluyen ácido d-glucónico, d-glucono-1,5-lactona y d-ribulosa 5-fosfato (la d-ribulosa 5-fosfato se identificó como nivel 4 por su nivel de confianza más bajo y no se muestra en la Tabla 2), y todos estaban regulados positivamente (Tabla 2). Son metabolitos intermedios de la rama oxidativa del PPP, y se ha informado que el PPP permite que la glucosa sirva como fuente de ribosa-5-fosfato en la biosíntesis de nucleótidos [46]. Por lo tanto, la rama oxidativa regulada positivamente del PPP probablemente suministra a los parásitos ribosa-5-fosfato (R5P), que produce ARN y ADN, y NADPH para su uso como reductor celular en el metabolismo celular. Recientemente, la PPP se ha convertido en una vía metabólica muy atractiva y viable en la investigación de fármacos contra la leishmaniasis, especialmente algunas enzimas que participan en ella [47,48,49,50], lo que se espera que conduzca al desarrollo de nuevos fármacos contra la leishmaniasis. .

Luego, encontramos que el metabolismo del triptófano se vio afectado visiblemente a 4 WPI y 12 WPI. El triptófano es un aminoácido esencial en los mamíferos y juega un papel importante en la inmunomodulación del huésped [51, 52]. El L-triptófano intracelular se cataboliza a través de dos vías principales: (1) conversión en quinurenina a través de la indoleamina 2,3-dioxigenasa o triptófano 2,3-dioxigenasa [53] y (2) conversión en un metabolito intermediario 5-hidroxitriptófano (5-HTP ) a través de triptófano hidroxilasa (TPH). En este estudio, los metabolitos diferenciales detectados a 4 WPI o 12 WPI estuvieron involucrados en la vía del 5-HTP. No se detectaron diferencias significativas en los metabolitos que coincidían con la vía de la quinurenina. Además, los metabolitos diferenciales que coinciden con la vía del triptófano a 4 WPI estaban todos regulados hacia abajo y hacia arriba a 12 WPI. Generalmente, la disminución de los metabolitos reflejó una biosíntesis reducida o un catabolismo mejorado. Leishmania es auxotrófica para el triptófano y carece de genes para su biosíntesis [54, 55]. Se informó que Leishmania donovani consume una gran cantidad de triptófano durante la infección in vitro [12], y el catabolismo en la vía del triptófano produce NAD+, que puede ayudar a mantener la homeostasis redox. Además, el agotamiento del triptófano en las células huésped suprimió la proliferación de células T y, por lo tanto, promovió la cronicidad de la enfermedad [51, 56]. Si la regulación negativa de los metabolitos en la vía 5-HTP estaba relacionada con el consumo de triptófano en la infección por Leishmania y, por lo tanto, atenuó la inmunidad del huésped en la etapa infecciosa anterior, necesita mayor validación experimental, especialmente estudios sobre el papel de la vía 5-HTP en la progresión de la LV.

Además, en el metabolismo de la tirosina, encontramos que la 3-nitrotirosina (3-nitro-l-tirosina) varió significativamente tanto a 4 como a 12 WPI. Según la Tabla 3, en comparación con los grupos de control, se reguló significativamente al alza más de tres veces a 4 WPI, mientras que se reguló a la baja más de dos veces a 12 WPI. La 3-nitrotirosina, también conocida como nitrotirosina, es un producto de la nitración de tirosina mediada por especies reactivas de nitrógeno como el anión peroxinitrito y el dióxido de nitrógeno. La 3-nitrotirosina es un biomarcador estable de estrés oxidativo bien establecido y un buen predictor de la progresión de algunas enfermedades, como las cardiovasculares y neurodegenerativas [57,58,59]. La mayor producción de 3-nitrotirosina estaba estrechamente relacionada con la mayor actividad microbicida en macrófagos infectados con Leishmania [60]. Un estudio previo reveló que la formación de 3-nitrotirosina es un indicador relevante de la actividad antiparasitaria [61]. Por lo tanto, la regulación positiva de la 3-nitrotirosina a las 4 WPI en la orina puede estar relacionada con el aumento de la actividad antiparasitaria de los macrófagos infectados en el período de infección más temprano, y la regulación negativa a las 12 WPI probablemente estuvo relacionada con la progresión a la etapa tardía de infección crónica de VL. Ciertamente, estas inferencias aún necesitan una validación profunda. Además, el metabolito taurina implicado en el metabolismo de la taurina y la hipotaurina se reguló positivamente a las 12 WPI. La taurina, uno de los aminoácidos más abundantes, posee propiedades antiinflamatorias e inmunorreguladoras [62] y protege contra diversos tipos de daño hepático [63, 64]. Sin embargo, se desconoce el papel de la taurina en el proceso de VL y si su regulación positiva está relacionada con la autolimitación de las lesiones patológicas en el hígado en este estudio.

En vista de la disponibilidad y el cumplimiento, la orina es el tipo de muestra que se puede tomar de forma no invasiva en grandes cantidades. La abundancia de metabolitos terminales del metabolismo bioquímico del cuerpo también hace que la orina sea una muestra valiosa en la búsqueda de biomarcadores [23, 27], y el descubrimiento de biomarcadores permite una mejor comprensión del mecanismo patogénico subyacente. En este estudio, se identificaron 12 metabolitos que variaron significativamente tanto a 4 como a 12 WPI. Mediante análisis ROC univariado, 7 de los 12 metabolitos mostraron un rendimiento relativamente satisfactorio para distinguir entre el grupo de infección y el grupo de control, con un AUC > 0,8 (Tabla 3). Por lo tanto, los siete metabolitos fueron designados como un posible panel de biomarcadores que se analizará para el diagnóstico. Los resultados de la prueba ROC multivariable sugirieron que el panel de biomarcadores seleccionado tenía una gran capacidad para distinguir los grupos de infección de los grupos de control a 4 y 12 WPI (Fig. 9A, B). Además, también se demostró la capacidad del panel de biomarcadores para separar los grupos de infección entre 4 y 12 WPI (Fig. 9C). Estos análisis mostraron que el panel de biomarcadores de siete metabolitos de la orina puede tener potencial en el diagnóstico de LV y el seguimiento de la etapa infecciosa, lo que valdría la pena realizar una validación adicional.

Según el cambio de fuerza iónica (Tabla 3; Fig. 9D), cinco de los siete metabolitos se regularon negativamente a 4 WPI y se aumentaron drásticamente a 12 WPI, cuyo mismo patrón de cambio implicaba que estos metabolitos pueden estar involucrados en vías metabólicas cercanas. Sin embargo, la mayoría de estos metabolitos carecían de información detallada en la biblioteca de compuestos existente. Entre los otros dos metabolitos, el Dl-5-metoxitriptófano (5-MPT) se reguló positivamente tanto en 4 WPI como en 12 WPI. El 5-MPT es un metabolito endógeno que se produce en los fibroblastos mediante una nueva vía metabólica del triptófano [65] y se ha confirmado que es capaz de defenderse contra respuestas inflamatorias sistémicas excesivas y sepsis [66]. También podría contribuir a reducir el crecimiento tumoral y la metástasis, así como a reducir la hiperplasia de la íntima en la enfermedad vascular [65, 67, 68]. Sin embargo, hasta la fecha no hemos visto ninguna investigación sobre el 5-MPT en la leishmaniasis. En estudios recientes, además de ser biomarcadores diagnósticos y terapéuticos de enfermedades, el 5-MPT también puede ser un compuesto líder valioso, y su sintetasa TPH-1 puede servir como marcador diana de algunas enfermedades [68,69,70,71]. . Por lo tanto, es necesaria una validación más específica del 5-MPT por su potencial diagnóstico. Mientras tanto, la investigación sobre la función biológica de la 5-MPT y la expresión de su sintetasa sería útil para comprender el papel de la 5-MPT en la progresión de la LV.

En este estudio, el análisis metabonómico de la orina reveló que el metabolismo de los hámsteres dorados se alteró significativamente después de la infección por Leishmania. Por lo tanto, el metabolismo de los aminoácidos se vio muy afectado en ambos momentos de infección. También presentó características metabólicas distintas en las etapas tempranas y tardías de la progresión de la LV. El número de metabolitos y vías metabólicas alteradas en 4 WPI fue obviamente mayor que en 12 WPI. Además del metabolismo de los aminoácidos, el metabolismo influenciado también involucró el metabolismo de los carbohidratos y nucleótidos a 4 WPI. Esto puede estar relacionado con las diferencias en las demandas de nutrientes de los parásitos y/o las respuestas inmunes del huésped en las etapas tempranas, medias y tardías de la LV. Además, los resultados de este estudio fueron bastante diferentes de los de nuestro estudio metabonómico anterior en suero, que reflejó que el metabolismo de los lípidos era la vía más influenciada después de la infección. En conjunto, los estudios metabonómicos de diferentes muestras biológicas ayudan a comprender mejor las características metabólicas de la LV. Los siete metabolitos se seleccionaron como un panel de biomarcadores potencial que tiene un buen potencial en el diagnóstico de VL en este estudio y merece una mayor validación, que se espera que contribuya al desarrollo de un nuevo enfoque de diagnóstico y seguimiento del curso de VL. Nuestro estudio ofrece además información metabólica más abundante sobre los huéspedes infectados por Leishmania, lo que esperamos proporcione una dirección novedosa para futuras investigaciones sobre los mecanismos moleculares de la infección por Leishmania.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementarios. Los datos sin procesar se cargaron en Metabolights, el número de acceso es MTBLS8191. Encuéntrelo en https://www.ebi.ac.uk/metabolights/MTBLS8191.

Semana post infección

leishmaniasis visceral

Análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales

Característica Operativa del Receptor

Análisis de componentes principales

doblar el cambio

Importancia variable para la proyección

Modo positivo y negativo en ionización por electropulverización.

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Descargar referencias

Agradecemos al Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan por proporcionar el aislado de Leishmania utilizado en este estudio y al Instituto de Genómica de Beijing por realizar la detección metabolómica.

Este proyecto fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención n.º 81802034) y los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (subvención n.º 2019SCU12014).

Departamento de Anatomía Humana, Escuela de Ciencias Médicas Básicas y Medicina Forense de China Occidental, Universidad de Sichuan, Chengdu, 610041, Sichuan, República Popular de China

Dongmei Yuan y Zhiwei Zhao

Departamento de Biología Patógena, Escuela de Ciencias Médicas Básicas y Medicina Forense del Oeste de China, Universidad de Sichuan, Chengdu, 610041, Sichuan, República Popular de China

Jianping Chen

Centro de ensayos clínicos, Segundo Hospital Popular de Chengdu, Chengdu, 610021, Sichuan, República Popular de China

Han Xiao Qin

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YDM diseñó la investigación. QHX diseñó los experimentos. YDM y QHX realizaron los experimentos. YDM y QHX analizaron los datos. CJP supervisó el estudio. ZZW ofreció el aparato experimental. YDM escribió el artículo.

Correspondencia a Zhiwei Zhao o Hanxiao Qin.

Los procedimientos de este artículo fueron auditados y permitidos por el Comité de Ética Médica del Departamento de Gestión Médica de la Universidad de Sichuan, y bajo cuyas directrices para el bienestar de los animales de experimentación se implementaron los experimentos.

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Condición de PCR en tiempo real para carga de Leishmania.

Método detallado para el pretratamiento de muestras de orina y el componente de los estándares internos.

Curva estándar de PCR en tiempo real.

Curvas TIC y gráficos PCA de muestras de control de calidad. (A) Las curvas TIC de las muestras de control de calidad estaban muy superpuestas. La izquierda representa el modo ESI + y la derecha representa el modo ESI-. (B) Gráficos PCA de muestras de control de calidad. Las flechas negras señalan los puntos de las muestras de control de calidad que estaban muy agregadas.

Gráficos PLS-DA de muestras experimentales en modo ESI-. (A) Control frente a infección a 4 WPI. R2 = 1,00, Q2 = 0,78. (B) Control frente a infección a 12 WPI. R2 = 0,99, Q2 = 0,62. (C) 4 WPI frente a 12 WPI del grupo de infección. R2 = 0,99, Q2 = 0,68.

Información detallada de los metabolitos diferenciales totales en este estudio.

Mapas de calor de metabolitos diferenciales a 4 WPI y 12 WPI en modo ESI-. (A) Resultados a 4 WPI en modo ESI-. (B) Resultados a 12 WPI en modo ESI-.

Información detallada sobre el estado coincidente de cada vía desregulada.

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Reimpresiones y permisos

Yuan, D., Chen, J., Zhao, Z. et al. Análisis metabolómico de la leishmaniasis visceral a partir de orina de hámster dorado. Vectores de parásitos 16, 304 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05881-3

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Recibido: 05 de abril de 2023

Aceptado: 12 de julio de 2023

Publicado: 30 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05881-3

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