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Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 14131 (2023) Citar este artículo

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La nitazoxanida (NTX) es un fármaco antimicrobiano que se utilizó para el tratamiento de diversos protozoos. Sin embargo, durante la pandemia de coronavirus, NTX se ha reorientado para el tratamiento de virus que infectan principalmente el sistema del tracto respiratorio. NTX se utiliza ahora como agente antiviral de amplio espectro. En este estudio, se desarrolló un método espectrofluorométrico ecológico y altamente sensible para detectar NTX en diversas formas farmacéuticas y su metabolito, tizoxanida (TX), en muestras de plasma humano utilizando nanosensores de puntos cuánticos de carbono co-dopados con nitrógeno y azufre (C-dots). Se utilizó un método hidrotermal simple y ecológico para sintetizar puntos C solubles en agua a partir de ácido cítrico y l-cisteína. Después de la excitación a 345 nm, se midió la intensidad de la luminiscencia a 416 nm. La extinción de la luminiscencia de los puntos C se produjo tras la adición de NTX y fue proporcional a la concentración de NTX. Se realizó una evaluación del mecanismo de extinción para demostrar que el efecto del filtro interno es el mecanismo molecular subyacente de la extinción de NTX. Después de optimizar todos los parámetros experimentales, el procedimiento analítico fue evaluado y validado utilizando las pautas de la ICH. Los límites de linealidad del método, detección y cuantificación de NTX fueron 15 × 10–3–15,00 µg/mL, 56,00 × 10–4 y 15 × 10–3 µg/mL, respectivamente. El método propuesto fue aplicado para la determinación de NTX en sus productos farmacéuticos comerciales; Nanazoxid® suspensión oral y tabletas. El % de recuperación, la desviación estándar relativa y el % de error relativo obtenidos fueron satisfactorios. La comparación con otros métodos espectrofluorimétricos informados reveló la sensibilidad superior del método propuesto. Esta alta sensibilidad permitió la determinación selectiva de TX, el principal metabolito de NTX, en muestras de plasma humano, lo que convierte a este estudio en el primer método espectrofluorimétrico en la literatura que determina TX en muestras de plasma humano. Además, el método de verdor se evaluó utilizando los enfoques Eco-Scale y AGREE para demostrar la superioridad del método de verdor propuesto sobre otros métodos espectrofluorimétricos publicados anteriormente para el análisis de NTX y su metabolito, TX, en diversas formas de dosificación y en muestras de plasma humano. .

La nitazoxanida (NTX), (acetato de 2-[(5-nitro-1,3-tiazol-2-il)carbamoil]fenil]) (Fig. 1a) es un medicamento antiparasitario oral sintético de amplio espectro que se sintetizó por primera vez en el Década de 1980. Se demostró que NTX es eficaz contra helmintos humanos, protozoos intestinales, bacterias anaeróbicas y virus. Se utiliza en el tratamiento de infecciones causadas por Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia o Clostridium difficile1,2,3,4. También se administra como fármaco único en el tratamiento de la bacteria Helicobacter pylori5. Tanto los virus de ARN como los de ADN son altamente susceptibles a su actividad, como la hepatitis B y C, la influenza A y los coronavirus (MERS, SARS, SARS-CoV-2)6,7. Además, desde la declaración del coronavirus como pandemia mundial por parte de la OMS el 12 de marzo de 20208, se realizaron diferentes estudios para investigar su efectividad hacia el tratamiento del COVID 19. Se ha demostrado que remdesivir y NTX trabajan juntos para tratar el SARS- Infección por CoV-2, mejorando la eliminación viral y reduciendo el riesgo de desarrollar resistencia9. Por otro lado, se demostró que la combinación NTX/azitromicina trata la tormenta de citocinas potencialmente mortal10. Además, el uso de NTX, ribavirina e ivermectina además de cápsulas de zinc para el tratamiento de COVID19 eliminó eficazmente el SARS-COV2 de la nasofaringe más rápido que la terapia sintomática11. NTX parece ser eficaz contra el SARS-CoV-2 durante el embarazo sin provocar efectos secundarios indeseables para el feto7. Con respecto al pico original de SARS-CoV-2 en Wuhan y varias variantes de reciente desarrollo, como la variante Delta, NTX pudo reducir significativamente la carga viral12, por lo que demostró ser un tratamiento seguro y asequible para la COVID 19.

(A) Estructuras químicas de nitazoxanida (NTX), (B) Espectros de excitación (línea continua) y emisión (línea discontinua) de puntos C en presencia (línea roja) y en ausencia (línea negra) de 5 µg/ml de NTX (λ emisión = 416 nm y λ excitación = 345 nm) y (C) UV: espectro de absorción visible de puntos C.

Una revisión reciente de la literatura mostró que se han empleado muchas técnicas analíticas para la cuantificación de NTX, como la espectrofotometría13,14,15, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)16,17, la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS)18, y electroquímicamente mediante técnica voltamétrica19. Ópticamente, NTX tiene un pico de absorción a 345 nm, sin embargo, no posee ninguna fluorescencia nativa. Hasta donde sabemos, se han informado dos estudios espectrofluorimétricos para la cuantificación de NTX. Abdel-Lateef et al.20 han determinado el NTX en tabletas o su metabolito en muestras de orina humana utilizando hipoclorito de sodio, que oxida el NTX a un producto altamente fluorescente. Mientras tanto, Qandeel et al.21 han utilizado puntos cuánticos sintetizados por plantas para el análisis de NTX en formas farmacéuticas en cápsulas.

Los puntos cuánticos de carbono fluorescentes son nanosensores únicos con características ópticas y eléctricas que dependen del tamaño22. Los puntos de carbono tienen distintos beneficios debido a sus propiedades ópticas únicas, tamaño extremadamente diminuto y alta relación superficie-volumen, como una fuerte fluorescencia sintonizable que va desde el ultravioleta profundo hasta el infrarrojo cercano, estabilidad contra el blanqueamiento y el parpadeo de las fotografías; además, pueden Absorben luz en un ancho de banda amplio y la emiten en un espectro estrecho. Los puntos de carbono son químicamente inertes, ecológicos y resistentes a la descomposición metabólica en bioaplicaciones; también son poco peligrosos en comparación con los puntos convencionales basados ​​en semiconductores23,24. Se han utilizado muchos métodos informados para la síntesis de puntos cuánticos de carbono fluorescentes, que incluyen: oxidación química25,26, estrategias de corte hidrotermal27, oxidación electroquímica28,29, carbonización a partir de rutas orgánicas30,31 y procedimiento asistido por microondas21. Sin embargo, la mayoría de los métodos antes mencionados requieren equipos complicados, procedimientos difíciles y no produjeron un alto rendimiento, por lo que no son los preferidos.

Hasta la fecha, numerosas publicaciones encontradas en la literatura han empleado puntos de carbono sintetizados mediante metodologías creativas en muchas aplicaciones farmacéuticas, estas incluyen: el uso de puntos cuánticos de carbono codopados con nitrógeno y azufre sintetizados en un solo recipiente para la determinación de salinomicina y maduramicina en muestras de alimentos32. Puntos cuánticos de carbono dopados con nitrógeno preparados asistidos por microondas utilizados para la obtención de imágenes celulares y la detección de palbociclib en células cancerosas vivas33. Puntos cuánticos de carbono dopados con azufre y nitrógeno hidrotermal de un solo recipiente para la determinación de olanzapina y diazepam en fluidos biológicos, formas de dosificación y aplicación a pruebas de uniformidad de contenido34. Un Green sintetiza puntos cuánticos de carbono dopados con nitrógeno, asistidos por microondas, utilizando jugo de naranja como fuente de carbono y urea como fuente de nitrógeno para la cuantificación del fármaco anticancerígeno dacomitinib a granel y en forma farmacéutica35. El ácido cítrico y la tiosemicarbazida se utilizaron como precursores para la preparación hidrotermal de puntos cuánticos de carbono dopados con azufre y nitrógeno para la estimación espectrofluorimétrica de gliclazida y saxagliptina36, algunos compuestos que contienen nitro37 y otras aplicaciones38.

En este estudio, se sintetizaron puntos cuánticos co-dopados con nitrógeno y azufre (puntos C) a partir de ácido cítrico y l-cisteína mediante un método hidrotermal simple de un solo paso donde el ácido cítrico sirve como fuente de carbono, mientras que la l-cisteína es la fuente. de nitrógeno y azufre24. Los C-dots sintetizados se utilizaron con éxito para la determinación sensible de NTX en diversas formas farmacéuticas y de tizoxanida (TX), el principal metabolito de NTX, en muestras de plasma humano. NTX se metaboliza inmediata y completamente mediante desacetilación a un metabolito activo TX después de su administración oral en humanos17,39. Además, el TX es el único metabolito detectado en las heces (dos tercios de la dosis de NTX). Además, se descubrió que TX era la única especie obtenida mediante incubación con microsomas humanos39. Tras la administración de una dosis oral de 500 mg de NTX, el TX tiene una Cmáx de 1,9 mg/l; de dos a seis horas después de la dosificación y una vida media terminal que oscila entre 1,03 y 1,6 h40. Hasta donde sabemos, no se informó anteriormente sobre ningún método espectrofluorimétrico para determinar TX en muestras de plasma humano. El método propuesto fue simple y altamente reproducible para la cuantificación de NTX y TX con alta selectividad y sensibilidad. Esta alta sensibilidad permitió la determinación sencilla de TX en muestras de plasma humano. Además, el desarrollo de métodos analíticos ecológicos ha sido recientemente uno de los principales focos de investigación41,42,43,44,45,46. Para ello, se utilizó el protocolo analítico de escala ecológica47 y el enfoque analítico de VERDE (AGREE)48 para aclarar el carácter ecológico del método propuesto, específicamente en lo que respecta al consumo de energía, la creación de residuos y productos químicos peligrosos. Después de comparar el método propuesto con otros métodos espectrofluorimétricos reportados para el análisis de NTX, nuestro método propuesto demostró tener una mejor sensibilidad para la determinación de NTX, teniendo la ventaja de ser más simple, menos costoso y más ecológico. Por lo tanto, nuestro método propuesto se puede utilizar fácilmente con fines de control de calidad y biodisponibilidad como una herramienta analítica simple, ecológica y eficiente.

La nitazoxanida (NTX) fue suministrada por la empresa médica Alandalous, Egipto. Se certificó su pureza (99,7 ± 0,72%). El ácido cítrico anhidro (99,9%) y la l-cisteína (98%) se adquirieron en Loba-Chemie (Mumbai, India). Los grados de reactivo analítico de ácido bórico, hidrogenofosfato disódico, hidróxido de sodio, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, metanol, etanol, acetona, alcohol isopropílico y acetonitrilo se obtuvieron de la compañía química El-Nasr, El Cairo, Egipto. Los agentes tensioactivos, cetrimida, Tween 80 y dodecilsulfato de sodio fueron suministrados por Sigma Aldrich, Alemania. Las muestras de plasma fueron proporcionadas amablemente por el Hospital Universitario El-Shatby, Banco de Sangre, Alejandría, Egipto, y se almacenaron congeladas hasta su uso. Durante todo el trabajo se utilizó agua fresca desionizada. Las preparaciones farmacéuticas involucradas en este estudio son la suspensión oral de Nanazoxid® etiquetada para contener 100 mg de NTX/5 ml y tabletas recubiertas con película de Nanazoxid® etiquetadas para contener 500 mg de NTX (Utopia Company for Pharmaceuticals Industry, El Cairo, Egipto).

Las mediciones espectrofluorométricas se llevaron a cabo utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia Cary Eclipse (Agilent technologies, EE. UU. (modelo: G9800A)). El instrumento estaba equipado con una celda de cuarzo de 1 cm y una lámpara de xenón de 150 W. Se utilizó un espectrofotómetro de luz UV-Vis Shimadzu (modelo 1800 de EE. UU.) y se midieron los espectros de espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR) utilizando Cary 360 FT-IR (tecnologías Agilent, EE. UU.). Se utilizó un microscopio electrónico TEM-1400 plus para examinar la morfología de los puntos C sintetizados. También se utilizaron un horno termo Heratherm OGS60 y un reactor autoclave hidrotermal de 100 ml de PTFE de acero inoxidable 316 grado A para la síntesis del reactivo de puntos de carbono. Además, serie centrífuga PLC. Modelo: PLC-03, potencia: 220 V/50 Hz; 0,65 A. Cultivo industrial Gemmy. se utilizó. Todas las mediciones de pH se registraron utilizando Crison Instruments SA (Barcelona, ​​España) y la sonicación se realizó con el sonicador de tecnología Soltec Soluzioni (Italia, modelo: 2200EP). Todas las mediciones fluorimétricas se realizaron a temperatura ambiente.

Se disolvieron ácido cítrico anhidro (1,82 g, 9,5 mmol/l) y l-cisteína (1 g, 8,3 mmol/l) en 10 ml de agua desionizada y luego la mezcla se evaporó a 70 °C durante 12 h para generar una almíbar espeso. Luego, este jarabe espeso se transfirió a un reactor autoclave hidrotermal de acero inoxidable revestido de teflón de 100 ml. Posteriormente, la mezcla se calentó hidrotermalmente en un horno de calentamiento a 200 °C durante 3 h a una velocidad de 10 °C min-1. Luego se dejó enfriar la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante varias horas y el producto de jarabe negro se neutralizó con una solución de NaOH 1 M y se diluyó con agua desionizada hasta 100 ml. Finalmente, se ultrasonicó durante 5 min a temperatura ambiente antes de la filtración24.

Se preparó una solución madre de NTX (500 μg/ml) en acetonitrilo. Se usó agua desionizada como disolvente verde para diluir la solución del fármaco y preparar otra solución madre diluida de 5 µg/ml, transfiriendo 0,5 ml a un matraz volumétrico de 50 ml. También se usa agua desionizada para obtener las soluciones de trabajo finales transfiriendo 0,1 ml del reactivo C-dots y se agregaron diferentes volúmenes de la solución madre del fármaco a un conjunto de matraces volumétricos de 10 ml y se completaron hasta completar el volumen con agua desionizada.

Para construir una curva de calibración para NTX, se prepararon soluciones de trabajo transfiriendo volúmenes precisos de la solución madre estándar de NTX que cubría el rango de concentración de 15 × 10–3–15,00 µg/mL a un conjunto de matraces volumétricos de 10 ml y 0,1 ml de C. Se añadió solución puntual a cada matraz. Se mezclaron las soluciones y se completó el volumen hasta la marca usando agua desionizada. La intensidad de fluorescencia de las soluciones de trabajo se midió a λ emisión = 416 nm (λ excitación = 345 nm). Las lecturas se dedujeron de la lectura correspondiente de un blanco que había recibido el mismo tratamiento. Se construyó un gráfico de calibración trazando la diferencia en la intensidad de la fluorescencia frente a las concentraciones correspondientes de NTX (μg/ml).

Para crear una solución con una concentración final de 500 μg/ml, se transfirió con precisión un volumen de 2,5 ml de suspensión oral de Nanazoxid® a un matraz volumétrico de 100 ml. Para extraer NTX, se agregaron 50 mL de acetonitrilo a la suspensión oral, se sonicó durante 15 min, se dejó enfriar, se completó hasta la marca con el mismo solvente (acetonitrilo) y luego se filtró. Posteriormente, se diluyeron cantidades precisas de la solución filtrada con agua desionizada para obtener soluciones de muestra con concentraciones dentro del rango de linealidad.

Se pesaron veinte tabletas de Nanazoxid® etiquetadas que contenían 500 mg de NTX para calcular el peso promedio de las tabletas. Después de triturar las tabletas, el peso promedio del polvo se transfirió a un matraz volumétrico de 100 ml. Para extraer el fármaco, se agregaron 50 mL de acetonitrilo al polvo, se sonicó durante 15 min, se dejó enfriar, se completó hasta la marca con acetonitrilo y luego se filtró. En un matraz volumétrico de 100 ml, se transfirieron 10 ml de la solución filtrada y se diluyeron con acetonitrilo para obtener una solución madre del fármaco con una concentración final de 500 µg/ml. Se utilizó agua desionizada para diluir la solución anterior para obtener soluciones muestra de concentraciones finales dentro del rango de linealidad indicado anteriormente, y se analizaron mediante el procedimiento descrito en “Construcción de la curva de calibración”. Finalmente, se calcularon los porcentajes de recuperación.

El método de Shalan et al.17 fue adaptado para la preparación de TX. El TX se obtuvo mediante hidrólisis ácida de NTX donde se agregaron 50 ml de HCl 1 M a 50 mg de NTX. La mezcla se mantuvo a reflujo durante 3 h a 100 °C. La preparación de TX se confirmó mediante manchado en placas de TLC de gel de sílice 60F254 y se reveló con cloroformo: metanol: solución de NH3: ácido acético en una proporción de 95:5:1:1 v/v y pH 5,8. El precipitado formado se filtró y se dejó secar a temperatura ambiente. Luego el polvo seco se usó en los siguientes experimentos.

Se trazaron curvas de calibración estándar para plasma humano enriquecido con cantidades variables de NTX o TX. Se transfirieron alícuotas de 200 µl de plasma a una serie de tubos de centrifugación. Se agregaron alícuotas de solución estándar de NTX o TX para obtener una concentración final dentro del rango de 0,015 a 5 μg/ml. Las mezclas se agitaron y se añadieron 0,5 ml de acetonitrilo para la precipitación de proteínas. Los tubos se agitaron durante 1 min y luego se centrifugaron a 3000 rpm durante 3 min. Luego se transfirió cuantitativamente el sobrenadante transparente a matraces volumétricos de 5 ml y se completó el volumen con agua desionizada. Las curvas de calibración se construyeron utilizando el procedimiento descrito en "Construcción de la curva de calibración". Simultáneamente se preparó un experimento en blanco. Luego se representó gráficamente la diferencia en la intensidad de la fluorescencia frente a la concentración final para obtener la curva de calibración. En consecuencia, se derivaron las ecuaciones de regresión correspondientes. Se prepararon muestras de plasma humano enriquecidas con diferentes cantidades de NTX o TX como se describe anteriormente y los contenidos recuperados de cada fármaco se cuantificaron utilizando su correspondiente ecuación de regresión.

El rendimiento cuántico de fluorescencia de los puntos C sintetizados se logró utilizando sulfato de quinina como referencia, activado con luz UV de 345 nm. Se calcula que es 73,0%24. Mientras que al utilizar 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) disuelto en dimetilsulfóxido como segundo estándar, se calcula que el rendimiento cuántico es del 71,2%. Estos hallazgos demuestran que los puntos C preparados exhiben un rendimiento cuántico relativamente alto (al menos 70%)24.

Las características ópticas de los puntos C sintetizados se evaluaron mediante espectroscopia de fluorescencia y absorción UV-Vis. Se midió la fluorescencia de los puntos C sintetizados. La Figura 1b demuestra su espectro fluorescente a una longitud de onda de emisión de 416 nm después de la excitación a 345 nm, lo que corrobora con Abd Elhaleem et al. trabajo publicado22. Mientras que tras la adición de 5 µg/ml de NTX a la solución de puntos C, se produce una extinción significativa de la fluorescencia de los puntos C, como se ilustra en la Fig. 1b. Además, se registró el espectro de absorción UV-Visible de los puntos C preparados (Fig. 1c) que muestra dos picos principales a 212 y 345 nm.

Para confirmar la estructura de los puntos C sintetizados, se midió el espectro infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR) de los puntos C. Los resultados se demuestran en la Fig. 2a. El espectro infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR) de los puntos C sintetizados mostró una vibración de estiramiento N – H a 3418 cm-1. La vibración de estiramiento carboxílico O-H se debió a una banda de absorción muy amplia de 3400 a 2500 cm-1. La vibración de estiramiento S – H se observó a 2578 cm-1. La vibración de estiramiento C=O para el ácido carboxílico se observó a 1713 cm-1 y para la amida carbonilo (Amida I) a 1634 cm-1. La vibración de estiramiento C=N (banda Amida II) se asignó a 1544 cm-1. Además, se realizaron imágenes TEM para explorar las características morfológicas y el tamaño de los puntos C. La Figura 2b muestra que los puntos C sintetizados tienen forma de esfera y el rango de distribución del tamaño de partícula fue de 2,18 a 9,8 nm.

(A) Espectro FTIR de los puntos C preparados y (B) imágenes TEM de puntos C.

Existen varios métodos que pueden dar como resultado la extinción de la fluorescencia, como la extinción dinámica, la extinción estática y el efecto de filtro interno (IFE)37. En este estudio, el espectro de absorción del fármaco mostró un alto grado de superposición con el espectro de excitación de los puntos C preparados. Esto se demuestra en la Fig. 3a. Por lo tanto, es posible que el IFE sea el mecanismo de extinción37. Para investigar el efecto del filtro interno, se calculó la intensidad de fluorescencia corregida de acuerdo con la siguiente ecuación35,37:

donde Fcorregida es la intensidad de fluorescencia corregida después de la eliminación de IFE, Fobservada es la intensidad de fluorescencia observada y Aex y Aem son la absorbancia de NTX en las longitudes de onda de excitación y emisión de los puntos C, respectivamente.

(A) Espectro de absorción de NTX superpuesto al espectro de excitación de los puntos C, (B) Eficiencia (%E) de la fluorescencia observada y corregida de los puntos C después de la adición de diferentes concentraciones de NTX y (C) Gráfico de Stern-Volmer de la interacción de NTX con puntos C a diferentes temperaturas (25 °C, 30 °C, 35 °C, 40 °C).

Después de esto, la eficiencia suprimida (%E) para la intensidad de fluorescencia corregida y observada se calculó utilizando la siguiente ecuación35,37.

donde F y F0 son las intensidades de emisión de la mezcla de puntos NTX-C y de los puntos C solos, respectivamente. Se construyó una gráfica de %E versus concentración de NTX. Los resultados ilustrados en la Fig. 3b demostraron una pérdida en la eficiencia de supresión que confirma que el IFE es el principal desencadenante de la extinción de la fluorescencia de los puntos C por parte de NTX.

Pueden tener lugar otros mecanismos además del IFE; se utilizó la ecuación de Stern-Volmer para determinar los otros posibles mecanismos que podrían ser responsables de la extinción de la fluorescencia nativa de los puntos C35,37.

donde F0 y F representan las intensidades de fluorescencia en ausencia y presencia del fármaco, respectivamente, Ksv representa la constante de extinción de Stern-Volmer y [NTX] es la concentración molar del fármaco.

Tanto la extinción estática como la dinámica se producen debido a la interacción molecular entre el fluoróforo y el extintor. En la extinción dinámica, durante el estado excitado, el extintor debe difundir al fluoróforo. Las moléculas no se alteran permanentemente como resultado del enfriamiento. Durante el enfriamiento estático, se crea un compuesto no fluorescente entre el extintor y el fluoróforo. La extinción puede resultar de procesos de estado excitado, creación de complejos de estado fundamental, reordenamientos moleculares, extinción por colisión, transferencia de energía/electrones y destrucción de grupos de emisiones49,50.

Para distinguir entre enfriamiento estático y enfriamiento dinámico, se exploró la dependencia de la temperatura del gráfico de Stern-Volmer50. El valor de Ksv aumenta al aumentar la temperatura en el caso de enfriamiento dinámico, mientras que disminuye al aumentar la temperatura en el caso de enfriamiento estático37. El enfriamiento por colisión tiene lugar a temperaturas más altas ya que la difusión ocurre más rápidamente. Por otro lado, la extinción estática es generalmente menos efectiva a temperaturas más altas debido a la disociación de complejos débilmente unidos50. Para ello, se midieron cinco concentraciones diferentes de NTX a varias temperaturas (25 °C, 30 °C, 35 °C, 40 °C) y se compararon los gráficos de Stern-Volmer obtenidos (Fig. 3c). Los resultados, demostrados en la Fig. 3c, muestran que la constante Ksv obtenida de todas las parcelas fue de ~ 0,022 L mol-1 y no se vio afectada por el aumento de temperatura. Como resultado, se excluyen tanto el enfriamiento estático como el dinámico, dejando al IFE como un mecanismo de enfriamiento esperado21. Para una mayor confirmación del mecanismo dilucidado, se representaron los espectros de absorción UV para NTZ, los puntos C y la mezcla de puntos NTZ-C (Fig. 4a) y no se observaron nuevos picos de absorción, lo que enfatiza que el mecanismo de extinción no es una extinción estática33. 35.

(A) Espectros de absorción de puntos C, NTX y mezcla de puntos NTX/C y (B) Espectros de emisión de fluorescencia de puntos C de 0,1 ml en solución acuosa tras la adición de varias concentraciones de NTX (0,0–15,0 μg/ml). El recuadro representa la curva de calibración correspondiente.

Se investigaron las condiciones de reacción para obtener la mayor extinción del fármaco analizado. Se optimizaron varios factores experimentales. Los parámetros estudiados fueron: tipo y pH del tampón, volumen del tampón, efecto de la adición de diferentes tensioactivos, tiempo de reacción y efecto del disolvente diluyente.

Se examinaron tampones tanto de borato (25 mM) como de fosfato (25 mM). Los efectos de diferentes pH para ambos tampones (pH 3, 5, 7 y 10) (Figs. S1a yb en información complementaria) y diferentes volúmenes de tampón de borato pH 7 (2 a 8 ml en incrementos de 2 ml) (Fig. S1c en información complementaria) sobre la extinción de puntos NTX-C se investigaron y se compararon con la extinción de soluciones acuosas de puntos NTX-C. Los resultados demostrados en la Fig. S1 no muestran una mejora considerable en la extinción de los puntos C utilizando cualquiera de los tampones. Por lo tanto, el pH no tuvo un impacto significativo en la extinción de los puntos C por parte del fármaco estudiado. En consecuencia, se utilizará agua desionizada como disolvente diluyente. Esto aumentará la simplicidad y el verdor del método propuesto.

Un estudio publicado anteriormente informó el efecto sinérgico del tensioactivo dodecilsulfato de sodio sobre la fluorescencia de los puntos C51. Por eso, se agregaron diferentes tensioactivos catiónicos, aniónicos y no iónicos a las soluciones medidas para examinar el efecto de extinción de NTX. Se seleccionaron cetrimida, lauril sulfato de sodio (SLS) y Tween 80 como tensioactivos catiónicos, aniónicos y no iónicos, respectivamente. Se probaron diferentes concentraciones para estudiar el efecto tensioactivo, cambiando la concentración de 0,002 a 0,008 M para cetrimida (Fig. S2a en información complementaria), de 0,005 a 0,02 M para SLS (Fig. S2b en información complementaria) y de 0,2% a 0,8 % para Tween 80 (Fig. S2c en información complementaria). La intensidad de fluorescencia de NTX-C-dots se registró en cada concentración y se comparó con la extinción de soluciones acuosas de NTX-C-dots. Los resultados demostrados en la Fig. S2 muestran que el mejor efecto de extinción de NTX se logró sin agregar tensioactivos. Por lo tanto, no se añadió ningún tensioactivo al método propuesto, lo que mejora la simplicidad y el verdor del método.

Para el análisis fluorimétrico se investigó el efecto de los disolventes de dilución. Se probaron diferentes solventes como: metanol, etanol, alcohol isopropílico, acetonitrilo, acetona, HCl 0,1 M, H2SO4 0,1 M, H3PO4 0,1 M, NaOH 0,1 M y agua desionizada. Como se ilustra en la Fig. S3a en información complementaria, el agua desionizada produjo el mejor efecto de extinción para los puntos C y maximiza la sensibilidad del ensayo. Esto puede atribuirse al hecho de que los disolventes más polares, como el agua desionizada, reducen la energía de transición π – π* y maximizan la energía de transición n – π*, lo que da como resultado una mejora de la intensidad de fluorescencia del reactivo52. Por lo tanto, se eligió agua desionizada como disolvente diluyente para el ensayo y esto hizo que el método fuera más simple, con menor costo y, lo que es más importante, ecológico.

El efecto del tiempo de reacción tras la adición de NTX a C-dots se probó en varios intervalos de tiempo de cero a 30 minutos. La intensidad de fluorescencia de la mezcla de puntos NTX-C se midió cada 5 minutos (Fig. S3b en información complementaria). Se observó que la reacción instantánea tiene lugar inmediatamente (en tiempo cero) tras la adición del fármaco a los puntos C. Además, la mezcla de reacción fue estable durante 30 min. En consecuencia, se descubrió que la incubación del fármaco con los puntos C durante un tiempo prolongado no tenía ningún impacto en la extinción de los puntos C, lo que hizo que la reacción fuera más sencilla y rápida.

Se siguieron las directrices Q2(R)1 del Consejo Internacional de Armonización (ICH) sobre validación de procedimientos analíticos para validar el rendimiento del método propuesto53. Los parámetros de validación se muestran en las Tablas 1 y S1 en información complementaria.

Para evaluar la linealidad de los métodos propuestos, se analizaron diferentes concentraciones del fármaco utilizando las condiciones óptimas mencionadas anteriormente. La intensidad de la fluorescencia de los puntos C se midió en el rango de concentración; 15 × 10–3–15,00 µg/ml. La Figura 4 demuestra la extinción resultante de la fluorescencia de los puntos C tras la adición de diversas concentraciones de NTX. Se aplicó el método de mínimos cuadrados para el análisis de regresión y se calcularon diferentes valores como coeficientes de correlación (r), interceptos (a), pendientes (b), desviación estándar del intercepto (Sa) y pendiente (Sb). La Tabla 1 presenta todos los valores estadísticos para el método propuesto. Los resultados muestran que se generó un buen gráfico de calibración lineal; esto fue verificado por los grandes valores de los coeficientes de correlación (valor del coeficiente de correlación > 0,999) y el % de RSD de la pendiente (Sb%) que no superó el 2%. Además, el valor de F bajo y significativo confirma la baja dispersión de los puntos experimentales alrededor de la línea de regresión. De manera similar, la pequeña desviación estándar residual (Sy/x) demuestra que los puntos trazados están muy cerca de la línea recta, lo que confirma la buena linealidad del método propuesto.

El límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ) se calcularon utilizando las ecuaciones proporcionadas por las directrices de la ICH. Donde LOD = 3,3 S/b y LOQ = 10 S/b, donde S es la desviación estándar (SD) de seis soluciones en blanco (es decir, seis soluciones de puntos C) y b es la pendiente de la curva de calibración. Los bajos valores calculados para LOD y LOQ indican una buena sensibilidad del método propuesto (Tabla 1).

Se analizaron tres concentraciones separadas utilizando tres determinaciones repetidas para cada una dentro del mismo día para examinar la precisión y exactitud intradía. De manera similar, la precisión y exactitud entre días se examinaron analizando los mismos tres niveles de concentración utilizando tres determinaciones repetidas para cada uno, repetidas en tres días consecutivos. La precisión del método fue confirmada por el porcentaje de recuperación satisfactorio (% de recuperación) (99–101,4%) y los pequeños valores de error relativo porcentual (%Er) que no excedieron el 2%. Además, la precisión de la metodología fue evaluada y probada por los bajos valores de porcentaje de desviación estándar relativa (%RSD) que no excedieron el 2,0%, lo que enfatiza la alta reproducibilidad y precisión del método desarrollado para la estimación de NTX en forma masiva (Tabla S1 ).

La selectividad del método propuesto se estudió observando el efecto de extinción de algunos fármacos coadministrados, como ribavirina y remdesivir, que se utilizan para el tratamiento de COVID-199,10,11 y claritromicina, que se utiliza en el tratamiento de H- infección pylori54. Al aplicar el método propuesto, todos los compuestos probados no mostraron ningún efecto de extinción en los puntos C utilizados. Además, los excipientes y aditivos que normalmente se encuentran en las preparaciones farmacéuticas no interfirieron en los métodos propuestos, como lo muestran los buenos porcentajes de recuperación ilustrados en la Tabla 2. Estos estudios respaldan la selectividad y especificidad de la metodología desarrollada.

El procedimiento propuesto se aplicó para el ensayo de NTX en las formas farmacéuticas disponibles en el mercado local. Los comprimidos recubiertos con película de Nanazoxid® (500 mg) y la suspensión oral de Nanazoxid® (100 mg/5 ml) se estimaron cuantitativamente utilizando el método fluorimétrico propuesto. Los porcentajes de recuperación se calcularon utilizando el método estándar externo. Los buenos resultados del ensayo mostraron exactitud y precisión aceptables, como lo ilustran los valores de % de recuperación, SD, % de RSD y % de Er presentados en la Tabla 2. Las formas de dosificación, otros excipientes y aditivos coformulados no tuvieron impacto en el ensayo de NTX. En consecuencia, en presencia de otros ingredientes coformulados, el método desarrollado demostró una especificidad y confiabilidad adecuadas.

El método se aplicó con éxito para el análisis de NTX y TX en plasma humano enriquecido. La Figura 5 demuestra la extinción resultante de la fluorescencia de los puntos C tras la adición de muestras de plasma humano enriquecidas con 2 μg/ml de NTX (Fig. 5a) y 2 μg/ml de TX (Fig. 5b). En las condiciones experimentales descritas anteriormente, se demostró una correlación lineal trazando la diferencia en la intensidad de la fluorescencia frente a la concentración de cada compuesto. Al someter los datos a un análisis de regresión lineal se obtuvieron las siguientes ecuaciones:

donde: FI es la diferencia en la intensidad de fluorescencia entre el blanco (es decir, puntos C) y los puntos C con NTX o TX añadidos, C es la concentración del fármaco (μg/mL) y r es el coeficiente de correlación. Los valores altos de coeficientes de correlación indican una buena linealidad de las curvas de calibración. El análisis estadístico de los datos demostró un porcentaje de error relativo bajo (Er%) como se muestra en la Tabla 3.

(A) Espectros de emisión de fluorescencia de 0,1 ml de puntos C en solución acuosa tras la adición de 2 μg/ml de NTX añadido en plasma humano y (B) Espectros de emisión de fluorescencia de 0,1 ml de puntos C en solución acuosa tras la adición de 2 μg/ml TX aumentó en plasma humano.

El rendimiento del método propuesto quedó demostrado por su aplicabilidad al plasma humano enriquecido con cuatro concentraciones diferentes de cada compuesto y determinado mediante la ecuación de regresión correspondiente. Los resultados del ensayo para la determinación de NTX y TX en plasma enriquecido utilizando el protocolo fluorimétrico propuesto se resumen en la Tabla 3.

Hoy en día existe un considerable interés por el impacto de los procesos químicos en el medio ambiente y la salud. Para eliminar por completo cualquier riesgo ambiental potencial, era vital establecer el carácter ecológico de las metodologías analíticas. Se utilizó la herramienta de estimación Eco-Scale, que es una técnica semicuantitativa que depende de la determinación de los puntos de penalización acordados con el Sistema Globalmente Armonizado (GHS) para el etiquetado de sustancias químicas, riesgos laborales, método de tratamiento, consumo de energía y volumen de residuos. . El total de puntos de penalización se deduce de "100", que representa el mejor valor de verdor. El puntaje calculado por el método propuesto fue 87, lo que revela un valor de verdor perfecto (Tabla 4)47. Recientemente, se ha utilizado un método diferente (evaluación AGREE) para proporcionar una evaluación imparcial del impacto ambiental de la metodología propuesta48. Para representar los 12 principios de la química analítica verde, AGREE proporciona un gráfico en forma de reloj con 12 porciones separadas. Por separado, cada parte se refiere a un principio que colorea rojo, amarillo y verde según el grado de verdor del procedimiento analítico. El valor total de la evaluación se muestra en el centro del gráfico DE ACUERDO en una escala de 0 a 1 (Tabla 4). Tanto las evaluaciones de AGREE como de Eco-greenness Scale respaldaron los mismos hallazgos.

Abdel-Lateef et al. informaron un método espectrofluorométrico que depende de la oxidación de NTX (no fluorescencia) en un producto altamente fluorescente mediante hipoclorito de sodio para la cuantificación de NTX20. Mientras tanto, Qandeel et al.21 han utilizado puntos cuánticos sintetizados por plantas para el análisis de NTX en formas farmacéuticas en cápsulas. La Tabla 4 muestra una comparación de nuestro método propuesto con otros métodos publicados anteriormente. Los resultados muestran que nuestro método sugerido es altamente sensible. Esta alta sensibilidad permitió la determinación selectiva de TX, el principal metabolito de NTX, en muestras de plasma humano, lo que convierte a este estudio en el primer método espectrofluorimétrico en la literatura que determina TX en muestras de plasma humano. Además, el procedimiento propuesto ofrece más ventajas: es económico, simple y no requiere procedimientos tediosos de varios pasos. Además, el método sugerido no requiere instrumentación costosa ni reactivos analíticos complejos. Además, la aplicación de agua como disolvente diluyente permite que el método desarrollado sea un sustituto más ecológico de los otros métodos informados anteriormente20,21 como se muestra en la Tabla 4. De esta manera, se demuestra que nuestro método propuesto es más ecológico. Además, el método propuesto puede resultar beneficioso para probar la pureza de los fármacos y realizar análisis de control de calidad de rutina. Además, ofrece la máxima sensibilidad sin necesidad de instrumentación difícil o costosa.

La combinación entre el uso de la técnica espectrofluorimétrica y el nanosensor de puntos cuánticos proporciona un método altamente sensible, rápido y factible para la determinación sensible de NTX dentro del rango de concentración de 15 × 10–3–15,00 µg/mL. Fue posible producir CQD dopados con nitrógeno y azufre con rendimientos altos y seguros que tenían mucho nitrógeno y azufre en su superficie al hacer reaccionar hidrotermalmente una solución acuosa de ácido cítrico con l-cisteína. Los puntos C actúan como nanosensores luminiscentes deseables para la determinación selectiva y sensible de NTX. Dependiendo de la necesidad de cantidades muy pequeñas de disolventes orgánicos y del uso de agua como disolvente diluyente, el método desarrollado es muy ecológico y ecológico. La fluorescencia nativa de los puntos C se extinguió eficientemente como resultado de superposiciones complementarias de la banda de absorción de NTX con los espectros de fluorescencia de excitación de los puntos C, lo que resultó en un efecto de filtro interno. Se demostró que el efecto del filtro interno es el mecanismo molecular subyacente de la extinción. Las ventajas obvias del método propuesto validado son la ecología, la simplicidad, la confiabilidad y el bajo costo. Además, el método demostró una alta sensibilidad que permitió la determinación de NTX en diversas formas farmacéuticas sin ningún tratamiento previo ni influencia de los excipientes comunes. Además, este método se considera el primer método espectrofluorimétrico que determina tanto NTX como su principal metabolito TX, en muestras de plasma humano con alta selectividad. Por lo tanto, los nanosensores luminiscentes propuestos pueden considerarse superiores a los métodos espectrofluorimétricos informados anteriormente.

Todos los datos estarán disponibles previa solicitud. Se debe contactar al autor correspondiente para cualquier dato requerido para el estudio realizado.

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Correspondencia a Amira F. El-Yazbi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Elbardisy, HM, Elnaggar, MM, Belal, TS et al. Nanosensores luminiscentes verdes de "apagado" para la determinación sensible de un agente antiviral antibacteriano desesperadamente fluorescente y su metabolito en varias matrices. Representante científico 13, 14131 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40946-4

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Recibido: 26 de marzo de 2023

Aceptado: 18 de agosto de 2023

Publicado: 29 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40946-4

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