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Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 878 (2023) Citar este artículo

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Las infecciones por Clostridioides difficile, una bacteria que ataca el intestino grueso (colon), afectan a un gran número de personas en todo el mundo. La colonización bacteriana está mediada por dos exotoxinas: las toxinas A y B. Los péptidos cortos que pueden administrarse al intestino e inhibir la actividad biocatalítica de estas toxinas representan una estrategia terapéutica prometedora para prevenir y tratar C. diff. infección. Describimos un enfoque que combina un algoritmo de diseño de unión de péptidos (PepBD), simulaciones a nivel molecular, un ensayo de detección rápida para evaluar la unión de péptido:toxina, un ensayo primario basado en células humanas y mediciones de resonancia de plasmón superficial (SPR) para desarrollar péptidos. inhibidores que bloquean la toxina A en las células epiteliales del colon. Se ha descubierto que un péptido, SA1, bloquea la toxicidad de TcdA en células epiteliales del colon humano (intestino grueso) de origen primario. SA1 se une a TcdA con una KD de 56,1 ± 29,8 nM medida por resonancia de plasmón superficial (SPR).

Clostridioides difficile (C. diff.) es una bacteria grampositiva formadora de esporas que infecta el tracto intestinal de humanos y animales. En la última década, C. diff. La infección ha sido la principal causa de diarrea e inflamación del colon en América del Norte y Europa1. En muchos casos, la infección por C. difficile es consecuencia de un desequilibrio microbiano provocado por un tratamiento excesivo con antibióticos como penicilina, carbapenem y fluoroquinolona2,3. Estos alteran el microbioma intestinal, permitiendo la germinación de C. diff. esporas y provocan la proliferación de bacterias y la posterior liberación de toxinas virulentas. En 2017, más de 200.000 personas resultaron infectadas con C. diff. resultando en 12.800 muertes sólo en los Estados Unidos4,5. La mayoría de las infecciones están asociadas con la atención hospitalaria y más del 80% de las muertes ocurren en personas mayores de 65 años6. El epitelio del colon es el principal sitio de infección, ya que las células epiteliales que recubren la pared intestinal son muy sensibles a los efectos de las toxinas de C. diff y C. diff coloniza preferentemente el colon7,8.

La patogenicidad de C. diff. deriva principalmente de dos toxinas principales: la Toxina A (TcdA) y la Toxina B (TcdB)9,10. C. diferencia. se adhiere a la pared intestinal utilizando las proteínas de su capa superficial y produce dos grandes toxinas Rho-glucosilantes, TcdA y B, que comparten ~63% de homología de secuencia11,12. Estas toxinas comprenden cuatro dominios: dominio de glucosiltransferasa (GTD), dominio de autoproteasa (APD), dominio de administración y dominio de oligopéptidos repetitivos combinados (CROP) (Fig. 1a). La C. diff. Las toxinas actúan a través de un mecanismo intracelular de cuatro pasos (Fig. 1b): (1) El dominio CROP, que se encuentra en el extremo C de las toxinas, se une a las moléculas de carbohidratos y proteínas en la superficie de las células epiteliales del colon. ; (2) el dominio de administración ayuda a translocar la toxina al citosol de las células diana; (3) el APD escinde el GTD del resto de la toxina; y (4) el GTD utiliza uridina difosfato glucosa (UDP-glucosa) para glucosilar las GTPasas de la familia Rho que están presentes en las células epiteliales intestinales. La glucosilación de estas GTPasas de la familia Rho altera la transcripción, la progresión del ciclo celular, la apoptosis y la regulación del citoesqueleto, lo que produce efectos citopáticos y citotóxicos16,17,18,19.

a Se ilustra la estructura cristalina de la toxina A con el dominio glucosiltransferasa (GTD, rojo), el dominio autoproteasa (APD, azul) y el dominio de administración (naranja) (PDB ID: 4R04). b Esquema de la toxicidad inducida por TcdA en células epiteliales humanas. c El sitio catalítico de TcdA (que se muestra en azul) en el GTD (rojo) juega un papel importante en la inducción de C. diff. infección.

Se han desarrollado múltiples enfoques terapéuticos para tratar C. diff. infección. La práctica habitual es el tratamiento con antibióticos (metronidazol y vancomicina), pero en un 20% de los casos la infección reaparece20. La exposición a estos antibióticos altera la comunidad microbiana en el intestino, facilitando la colonización por C. diff21. Merck introdujo un anticuerpo monoclonal, Bezlotoxumab, (comercializado como Zinplava) que se dirige a la toxina B de C. diff. Si bien la tasa de infección recurrente entre los pacientes que recibieron Bezlotoxumab fue sustancialmente menor que la de las cohortes tratadas con antibióticos, el alto costo de una dosis única (~ $4 K) y su infusión intravenosa son onerosos22,23. Otro C. diff. El tratamiento es el trasplante de microbiota fecal (FMT), un tratamiento en investigación aún no aprobado por la FDA24. Los métodos de administración de FMT y las estrategias de dosificación óptimas aún varían de un caso a otro. Además, el TMF conlleva el riesgo de transmitir enfermedades infecciosas y bacterias resistentes a los antibióticos25.

Los péptidos cortos son candidatos prometedores para la prevención y el tratamiento de C. diff. infección, ya que son rentables y pueden tener una acción específica. Por tanto, el objetivo de este estudio es identificar inhibidores peptídicos que se unan al dominio catalítico de C. diff. Toxina A GTD combinando diseño computacional, simulaciones a nivel molecular y refinamiento experimental. Para ello empleamos PepBD, un algoritmo de diseño de unión de péptidos computacional (PepBD) desarrollado en nuestro grupo, que realiza una detección de alto rendimiento de aglutinantes de péptidos a objetivos biomoleculares26,27,28,29, por ejemplo, proteínas y ARN. El algoritmo PepBD se ha utilizado con éxito en el pasado para diseñar péptidos de unión a ARN Lys3 de transferencia de 15 unidades30, péptidos que reconocen la troponina cardíaca I31 y el neuropéptido Y32, ligandos peptídicos que se unen a los dominios Fc y Fab de la inmunoglobulina G33,34 y péptidos que se unen a al dominio de unión al receptor de la proteína de pico del SARS-CoV-235. En un esfuerzo por clasificar y evaluar los péptidos sugeridos computacionalmente, se utilizó una plataforma basada en perlas de microfluidos para identificar rápidamente los péptidos que exhiben las características de unión deseadas. Este sistema utiliza imágenes de fluorescencia y análisis de imágenes automatizado para medir la propensión a la unión tanto dentro como fuera del objetivo y se ha aplicado previamente para identificar péptidos que se unen específicamente a fragmentos Fab de Cas9, VCAM-1 e IgG36,37,38. La eficacia de los péptidos se prueba mediante un ensayo de resistencia eléctrica transepitelial (TEER) en monocapas del modelo de cultivo epitelial del intestino humano y mediante mediciones de resonancia de plasmón superficial.

El punto de partida para el trabajo descrito en este artículo es nuestro péptido de 10 unidades previamente identificado computacionalmente, "NPA", que se une a TcdA GTD39. Nuestra elección de objetivo proteico es TcdA GTD, ya que se basa en la investigación realizada en el laboratorio Feig de la Universidad Estatal de Wayne y aborda la necesidad insatisfecha de terapias eficaces dirigidas a TcdA40. En su estudio, emplearon la presentación en fagos para identificar péptidos cortos que demuestran afinidad de unión a TcdA GTD. Este péptido neutraliza el TcdA en las células absorbentes diferenciadas del intestino delgado (SI), pero no tiene ningún efecto sobre las células absorbentes diferenciadas del colon. Si bien se desconocen los mecanismos de esta observación, una posible explicación es que las proteasas presentes en el borde en cepillo de las células SI escinden los péptidos de 10 unidades en formas más cortas y más activas que neutralizan las toxinas en las células SI. Dado que las células epiteliales del colon no expresan proteasas de manera apreciable41, es menos probable que los péptidos de 10 unidades se escindan en las células del colon que en las células SI y, por lo tanto, no pueden neutralizar las toxinas en las células del colon.

En este trabajo, diseñamos variantes diseñadas computacionalmente del péptido NPA de menos de 10 aminoácidos con el objetivo de identificar inhibidores eficaces de C. diff. TcdA. Comenzamos realizando simulaciones de dinámica molecular de fragmentos de NPA para ver cuáles de ellos pueden unirse al sitio catalítico de TcdA GTD. Los resultados de la simulación predicen que los candidatos a péptidos de 8 unidades son óptimos. Por lo tanto, aplicamos el algoritmo PepBD para diseñar secuencias peptídicas de 8 unidades con NPA de 8 unidades como "péptido de referencia". Se llevan a cabo simulaciones explícitas de MD atomística con solvente y cálculos de energía libre de unión para evaluar la unión de los péptidos sugeridos in silico al TcdA GTD en solución. Los péptidos se analizan rápidamente para determinar la unión de TcdA y la unión de TcdA GTD a través de un sistema interno de presentación de péptidos basado en perlas para eliminar los inhibidores de péptidos débiles. La eficacia de los péptidos que superan el ensayo de presentación de péptidos basado en perlas se prueba utilizando un ensayo de resistencia eléctrica transepitelial (TEER) en monocapas del modelo de cultivo epitelial del intestino humano. Mientras que los ensayos de toxicidad celular convencionales para las toxinas de C. diff utilizan células de cáncer de colon no fisiológicamente relevantes o células epiteliales de riñón transformadas, aquí utilizamos células madre epiteliales del intestino humano primarias del intestino grueso (colon descendente) que se diferencian en el linaje principal (absortivo). ) del revestimiento intestinal. La afinidad de unión experimental del péptido de mejor rendimiento a TcdA se caracteriza mediante resonancia de plasmón superficial (SPR).

Los aspectos más destacados de nuestros resultados son los siguientes. Se identificaron siete inhibidores peptídicos candidatos (SA1-SA7) utilizando nuestro algoritmo PepBD junto con simulaciones a nivel molecular. Con base en la pantalla de visualización de péptidos basada en perlas para la unión de TcdA GTD, se seleccionaron cuatro péptidos (SA1-SA4) para una evaluación adicional in vitro. SA1 fue el único péptido que demostró propiedades de neutralización de TcdA en el colon. La constante de disociación, KD, de SA1 a TcdA medida por SPR es 56,1 ± 29,8 nM. Estos hallazgos sugieren que el péptido SA1 podría ser un fármaco terapéutico eficaz para tratar C. diff. infección.

Comenzamos determinando qué fragmento de NPA desempeña el papel más importante en la unión al dominio catalítico TcdA GTD, ya que este fragmento puede servir como péptido de referencia en nuestro proceso de diseño. El NPA se identificó en nuestro estudio anterior39, que informó secuencias peptídicas de 10 unidades diseñadas computacionalmente (Tabla complementaria 1) que se probaron experimentalmente utilizando un ensayo de cultivo celular funcional para determinar su capacidad para neutralizar el TcdA en el intestino delgado (yeyuno) y el intestino grueso (colon). ) células. El péptido de referencia utilizado para inicializar el diseño computacional en ese estudio fue RP: EGWHAHTGGG (Fig. 2a), descubierto por el equipo de Feig en la Universidad Estatal de Wayne41 mediante presentación en fagos y verificado experimentalmente por ellos para inhibir la actividad glucosiltransferasa de TcdA. Utilizando nuestro algoritmo PepBD26,27,28,29 y simulaciones de dinámica molecular, identificamos el péptido NPA: DYWFQRHGHR (Fig. 2c) que se une a TcdA GTD. Los residuos críticos en RP implicados en la unión a TcdA GTD son E1, W3, H4 y H6, mientras que los residuos críticos en NPA implicados en la unión a TcdA GTD son W3, R6 y H9. Los residuos clave que interactúan en TcdA GTD se encuentran dentro del bucle reactivo, a saber. residuos 509–526. En nuestro trabajo anterior se puede encontrar un análisis detallado de la interacción residuo-residuo entre RP:TcdA GTD y NPA:TcdA GTD. Las secuencias de aminoácidos de los residuos 509 a 526 se proporcionan en la Nota complementaria 1. Los péptidos RP y NPA mostraron actividad neutralizante de toxinas en las células del yeyuno, pero no mostraron ningún efecto en las células del colon. Dado que las células del intestino delgado expresan proteasas en el borde celular de la célula para descomponer las proteínas de la dieta41, especulamos que cuando se aplicó NPA a las células del yeyuno, se escindía en fragmentos más pequeños con actividad neutralizante. Realizamos LC-MS/MS en sobrenadantes de cultivos celulares de monocapas de colon después del péptido NPA y confirmamos la presencia de péptidos más cortos derivados de NPA de longitud completa. Esto no es sorprendente ya que la expresión de proteasas comunes en el colon está casi ausente42. Por lo tanto, partiendo del supuesto de que los péptidos de menos de 10 unidades podrían actuar como inhibidores de toxinas más potentes, modificamos nuestro enfoque de diseño computacional.

un péptido RP (EGWHAHTGGG) en el sitio catalítico del dominio de glucosiltransferasa de la toxina A y (b) la descomposición por residuos del gráfico de energía de interacción del péptido RP. c Péptido NPA (DYWFQRHGHR) en el sitio catalítico del dominio de glucosiltransferasa de la toxina A y (d) la descomposición por residuos del gráfico de energía de interacción del péptido NPA. El TcdA GTD se muestra en rojo y el péptido está coloreado en azul. e Tabla que muestra las predicciones de la simulación de dinámica molecular sobre si los fragmentos de 6, 7 y 8 unidades en RP y NPA se unen o no a TcdA GTD (f) Estructura inicial para PepBD: péptido de referencia NPA (8 unidades) unido al TcdA GTD en el sitio catalítico con un \({\triangle G}_{{binding}}\) de −6,35 kcal/mol.

Con base en las observaciones experimentales descritas anteriormente, procedimos a probar mediante simulaciones a nivel molecular si los péptidos de menos de 10 meros pueden unirse al TcdA GTD. Primero, realizamos simulaciones de dinámica molecular atomística de RP y NPA unidos al dominio catalítico de TcdA GTD. Se generaron gráficas de la energía de interacción (términos de van der Waals + electrostático + energía de solvatación polar) de cada uno de los diez residuos a lo largo de la secuencia peptídica con el sitio catalítico de TcdA GTD. Los resultados indican que los residuos en el extremo N de los péptidos tienen una mayor contribución a la energía de interacción con el sitio catalítico de TcdA GTD que los residuos flanqueantes en el extremo C de los péptidos (Fig. 2b, d). En segundo lugar, simulamos fragmentos de 6, 7 y 8 unidades de péptidos RP y NPA unidos al dominio catalítico de TcdA GTD. Las simulaciones revelan que los fragmentos de 6 y 7 unidades de RP, EGWHAH y EGWHAHT no son estables \((es decir,\,{{{{{\boldsymbol{\triangle }}}}}}{G}_{ {binding}} > 0)\) cerca del sitio de unión de TcdA GTD, mientras que el fragmento de 8 unidades EGWHAHTG se une a TcdA GTD con una energía libre de unión de \({{{{{\boldsymbol{\triangle }}}} }}{G}_{{unión}}=-5,79\frac{{kcal}}{{mol}}\)). Por el contrario, los fragmentos de NPA de 7 y 8 unidades, a saber, DYWFQRH de 7 unidades y DYWFQRHG de 8 unidades (\({{{{{\boldsymbol{\triangle }}}}}}{G}_{ {enlace}}\,{{{{{\rm{for}}}}}}\,8-{{{{{\rm{mer\; NPA}}}}}}=-6.35\frac{{ kcal}}{{mol}}\)) muestran una buena afinidad de unión por el TcdA GTD (Fig. 2e). En consecuencia, resolvimos diseñar variantes de péptidos de 8 unidades utilizando DYWFQRHG como ligando de referencia para el algoritmo PepBD.

PepBD es un algoritmo de diseño de unión de péptidos basado en Monte Carlo que utiliza un procedimiento iterativo para optimizar la afinidad de unión y la selectividad de los péptidos a un objetivo biomolecular. El algoritmo utiliza como entrada la estructura del complejo formado entre una secuencia peptídica inicial (péptido de referencia) y la biomolécula objetivo y selecciona variantes peptídicas implementando movimientos de cambio de secuencia y conformación en la cadena peptídica. Las propiedades de hidratación deseadas de los péptidos diseñados se pueden personalizar en función de 6 tipos de residuos (hidrófobos, hidrófilos, positivos, negativos, otros y glicina). La clasificación de los 20 aminoácidos naturales en los seis tipos de residuos se puede encontrar en la Tabla complementaria 2. Una función de puntuación, \({\varGamma }_{{score}}\), que considera (i) la energía de enlace de los péptido al receptor y (ii) la estabilidad conformacional del péptido cuando se une al receptor, se utiliza para evaluar la aceptación de nuevos péptidos candidatos. Los detalles del algoritmo se proporcionan en la sección Métodos.

Implementamos el algoritmo PepBD para identificar un conjunto mejorado de inhibidores peptídicos utilizando el complejo NPA: TcdA GTD de 8 unidades (Fig. 2f) como estructura de entrada. El \({{{{{\boldsymbol{\triangle }}}}}}{G}_{{binding}}\) del NPA de 8 unidades unido al TcdA GTD es −6,35 kcal/mol. Nuestro objetivo es utilizar PepBD para generar nuevas secuencias que puedan unirse al TcdA GTD con mayor afinidad de unión que el NPA de 8 unidades. Investigamos tres casos con diferentes conjuntos de propiedades de hidratación para la cadena peptídica. Para los tres casos, aseguramos la diversidad en la composición de aminoácidos de la cadena peptídica al permitir un equilibrio entre las diversas contribuciones a la energía de unión, a saber, electrostática, hidrófoba, enlaces de hidrógeno, π-π, etc., lo que contribuye a la afinidad del péptido y selectividad. Los tres casos son los siguientes. Caso uno: Nhidrofóbico = 3, Nhidrofílico = 2, Npositivo = 2, Nnegativo = 1, Nother = 0 y Nglicina = 0, Caso dos: Nhidrofóbico = 3, Nhidrofílico = 2, Npositivo = 1, Nnegativo = 1, Nother = 0 y Nglicina = 1 y Caso Tres: Nhidrofóbico = 1, Nnegativo = 3, Npositivo = 2, Nnegativo = 1, Nother = 0 y Nglicina = 1. Para cada caso realizamos la búsqueda de PepBD con tres números de semillas aleatorios iniciales diferentes para aleatorizar el secuencia peptídica. Esto permite que nuestros diseños avancen a lo largo de diferentes vías de búsqueda y tomen muestras de péptidos de un gran conjunto de secuencias y conformaciones de péptidos. Durante la evolución in-silico, se generan nuevas secuencias y confórmeros mutando e intercambiando aminoácidos en la cadena peptídica, lo que resulta en una fluctuación de la puntuación. Una puntuación Γ más baja significa una mayor afinidad de unión de un péptido al objetivo unido. La desviación cuadrática media, RMSD, de los nuevos confórmeros peptídicos en comparación con la conformación de la cadena peptídica inicial refleja los cambios en la estructura principal del péptido a medida que avanza el proceso de diseño. La Fig. 3a muestra la puntuación Γ y el perfil RMSD frente al número de movimientos de cambio de secuencia y conformación realizados con una semilla aleatoria inicial distinta para el Caso 1. La Fig. 3b muestra la estructura de uno de los péptidos de mejor rendimiento, SA1: EFWWRRHN, complejado con la interfaz de enlace TcdA GTD del Caso 1 (semilla aleatoria 1). El péptido SA1 tiene una puntuación Γ = −44,59 que se obtuvo en el paso 459 de la evolución de la secuencia. Del Caso 2 (semilla aleatoria 3), el péptido de mejor rendimiento es SA3 QEWMGRHW (Nota complementaria 2, Fig. 1A, C complementaria), y del Caso 3 (semilla aleatoria 3), el péptido de mejor rendimiento es SA6 EGWQHRHR (Nota complementaria 2, Suplementaria Figuras 1B, D); Se proporciona más información sobre SA3 y SA6, y los Casos 2 y 3 en la Nota complementaria 2. Una lista completa de las secuencias peptídicas principales obtenidas de PepBD, con su correspondiente caso, semilla aleatoria, \({\varGamma }_{{score} }\), \({\triangle G}_{{binding}}\) y si se evaluaron experimentalmente o no se proporciona en la Tabla complementaria 3.

a La puntuación/RMSD frente al número de pasos de secuencia y conformación para el Caso 1 con una semilla aleatoria inicial distinta da como resultado (b) péptido SA1: EFWWRRHN (c) Instantánea del péptido SA1 unido a TcdA GTD obtenida a partir de una simulación de dinámica molecular. Se muestra la conformación del péptido en la interfaz de unión. d Gráfico que muestra la descomposición en residuos de la energía de interacción (van der Waals + electrostática + contribución de energía de solvatación polar) en el complejo SA1: TcdA GTD.

Una vez que termina la evolución in-silico, realizamos simulaciones de dinámica molecular atomística (MD) con solvente explícito de los complejos formados entre los péptidos con puntuación más baja y TcdA GTD para predecir su afinidad de unión. Cabe señalar que \({\varGamma }_{{score}}\) no es una medida precisa de la energía libre de unión de un péptido unido a TcdA GTD, sino que es más bien una métrica importante que podemos utilizar para seleccionar el péptidos que nos gustaría avanzar para realizar simulaciones explícitas de MD con disolventes. Se realizan tres simulaciones independientes para cada péptido: complejo TcdA GTD durante 100 ns para asegurar que el sistema alcance un estado de equilibrio. Las simulaciones se realizan a 298 K utilizando el campo de fuerza AMBER ff14SB y el paquete AMBER18. Calculamos el \({\triangle G}_{{binding}}\) del complejo péptido:receptor siguiendo las simulaciones MD utilizando el protocolo MMGBSA y el método de constante dieléctrica variable. Los detalles de nuestra simulación atomística de MD y el procedimiento de cálculo de \({\triangle G}_{{binding}}\) se proporcionan en Métodos y material complementario26,27,28,29,43. La Tabla 1 informa los péptidos principales que obtenemos de nuestro procedimiento computacional y sus puntuaciones correspondientes y valores \({\triangle G}_{{binding}}\). Realizamos algunas simulaciones de 500 ns en complejos péptido:proteína seleccionados y concluimos que no hubo cambios conformacionales importantes en escalas de tiempo prolongadas (consulte la Nota complementaria 3, la Figura complementaria 2, las Tablas complementarias 4 y 5). SA1 es el péptido más prometedor con un valor \({\triangle G}_{{binding}}\) de −15,94 kcal/mol. (Nota: cuanto menor sea el valor de \({\triangle G}_{{binding}}\), mayor será la afinidad de unión). En la Fig. 3c se muestra el complejo SA1: TcdA GTD obtenido al realizar un análisis de agrupamiento jerárquico en los últimos 5 ns de una simulación MD de 100 ns. Además, en la Fig. 3d se muestra la gráfica de la descomposición en residuos de la energía de interacción entre SA1 y el sitio catalítico de TcdA GTD. El gráfico revela que los residuos SA1 críticos implicados en la unión de TcdA GTD son Trp3, Trp4, Arg5, Arg6, His7 y Asn8. Por tanto, triptófano, arginina, histidina y asparagina en SA1 son los cuatro aminoácidos esenciales para la unión de TcdA GTD. En la Nota complementaria 4 y en la Fig. 3 complementaria se proporciona una discusión detallada de las interacciones de aminoácidos clave de SA1 con TcdA GTD. Las firmas de secuencia de aminoácidos en los péptidos de unión a TcdA GTD de C. diff se derivaron de la composición de residuos del 1% superior de los péptidos con puntuación más baja identificados por PepBD para los casos 1 y 2 (consulte la Nota complementaria 5, la Figura complementaria 4, la Tabla complementaria 6).

Los inhibidores peptídicos candidatos sugeridos por PepBD fueron preseleccionados in vitro para determinar su unión potente y selectiva a TcdA GTD para eliminar los inhibidores débiles antes de los ensayos basados ​​en células. La fuerte inhibición de la actividad de la TcdA glucosiltransferasa se basa en la capacidad de los péptidos para superar al sustrato de TcdA GTD, la UDP-glucosa. Dada la constante de Michaelis relativamente baja de TcdA (KM ~ 4,5 μM) en comparación con la concentración celular de su sustrato UDP-glucosa (92 μM), es especialmente importante que los péptidos exhiban una alta fuerza de unión y selectividad a TcdA GTD (consulte el material complementario para obtener información detallada). análisis)11,44,45,46,47.

Utilizando un sistema de detección de microfluidos desarrollado por nuestro equipo en trabajos anteriores36,38, implementamos un ensayo de fluorescencia dual para evaluar la actividad inhibidora de TcdA GTD de los péptidos candidatos SA1-SA7, NPA de 8 unidades y RP de 8 unidades (Fig. 4a). ). Cada secuencia peptídica se inmovilizó en una perla translúcida de ChemMatrix Aminomethyl que luego se puso en contacto con TcdA marcado con fluorescencia roja (TcdA-AF594) y con un análogo verde fluorescente de UDP-Glucosa (UDP-Glucosa-Fluoresceína). Las perlas que presentan péptidos que se unen a TcdA exhiben una señal de fluorescencia roja; las perlas exhiben fluorescencia verde cuando la UDP-Glucosa-Fluoresceína se une al sitio catalítico del TcdA GTD. Por lo tanto, los péptidos que pueden unirse selectivamente al TcdA GTD y desplazar la UDP-Glucosa-Fluoresceína del sitio catalítico exhibirán fluorescencia roja, pero no verde. Las perlas se analizan mediante un ensayo de alto rendimiento (350 perlas por hora) que correlaciona la intensidad de fluorescencia de las perlas con la fuerza de unión y la selectividad de los péptidos mostrados. Las imágenes de cada perla se analizan mediante un algoritmo personalizado que garantiza una caracterización consistente y objetiva de las perlas dentro de un conjunto analizado.

a Esquema para la captura de perlas y la obtención de imágenes en un microscopio y un dispositivo de microfluidos personalizados. b Intensidad media de rojo y verde (valor de 0 a 255 píxeles) del área roja del percentil 90 (halo TcdA) de perlas que muestran cada péptido (número de perlas (n) = 23, 20, 25, 19, 23, 21, 15, 36 , 14, 8, 7 respectivamente). RP (-T) y RP (-T -U) no son controles TcdA-AF594 ni TcdA-AF594/UDP-Glucosa-Fluoresceína, respectivamente. c Cambio porcentual en la fluorescencia verde desde la región del halo rojo del percentil 90 al verde del percentil 50; los valores más negativos indican la exclusión de UDP-glucosa de la interfaz péptido:TcdA y, por tanto, la unión selectiva del péptido al TcdA GTD (* p < 0,005). d Imágenes compuestas representativas en rojo y verde para cada péptido.

Las perlas que muestran péptidos de unión a TcdA acumulan TcdA-AF594 en su superficie, lo que produce un característico halo de fluorescencia roja. Esto se debe a que el TcdA es bastante grande (PM = 308 kDa, 2710 residuos) y, por lo tanto, se difunde mal en los poros estrechos de las perlas. La intensidad del halo se correlaciona con la cantidad de TcdA-AF594 unido38 (Fig. 4b). Las perlas que muestran péptidos selectivos de unión a TcdA GTD desplazan a la UDP-glucosa-fluoresceína del GTD y, por lo tanto, la unión del péptido: TcdA GTD se puede observar como una pérdida de fluorescencia verde de la región de unión a TcdA (Fig. 4c).

El rendimiento de los péptidos (SA1-SA7, NPA de 8 unidades y RP de 8 unidades) se infirió en función de la intensidad de la fluorescencia del halo rojo y de la pérdida de fluorescencia verde de las perlas, respectivamente (Fig. 4d). SA1 fue el péptido de unión a TcdA más prometedor con la fluorescencia media de halo rojo más alta. A pesar de tener una alta fluorescencia verde, hubo una reducción significativa (p = 0,0011) en la fluorescencia verde desde el centro de las perlas hasta la interfaz de unión péptido:TcdA en comparación con el control sin TcdA-AF594 sin UDP-Glucosa-Fluoresceína ( RP (-T -U)) (Fig. 4c), lo que significa que SA1 se unió selectivamente a TcdA GTD. SA1, SA2, SA3 y SA4 tenían una fluorescencia media de halo rojo más alta y, por lo tanto, una mayor unión de TcdA que el NPA de 8 unidades. SA1, SA3 y SA4 tenían una fluorescencia media de halo rojo más alta y, por lo tanto, una mayor unión a TcdA que la RP de 8 unidades. En particular, todos los péptidos que se seleccionaron mostraron unión a TcdA; sin embargo, los péptidos de los Casos 1 (SA1, SA2, SA4) y 2 (SA3, SA5) tuvieron un rendimiento significativamente mejor que los del Caso 3 (SA6, SA7). Todos los péptidos, excepto SA7, mostraron una disminución significativa (p <0,005) en la fluorescencia verde desde el centro hasta la región del halo (unión de TcdA), lo que indica una exclusión relativamente universal de UDP-glucosa de la interfaz péptido:TcdA (Fig. 4d). A pesar de las diferencias en la fluorescencia verde de fondo entre péptidos, la disminución uniforme de la fluorescencia verde en el halo de TcdA proporcionó poca información para diferenciar entre péptidos. La unión selectiva de la mayoría de los péptidos diseñados con PepBD al TcdA GTD demuestra la solidez del algoritmo de diseño de péptidos para identificar de manera confiable los aglutinantes de péptidos en bolsas particulares. Se seleccionaron para una evaluación adicional los péptidos SA1-SA4, que tenían una fluorescencia roja más alta que el NPA y, por lo tanto, una unión prometedora a TcdA.

Se examinaron los péptidos SA1-SA4 en un sistema de cultivo epitelial de colon humano para evaluar preliminarmente las capacidades neutralizantes. En este sistema de ensayo, las células madre epiteliales del colon se aplican a insertos Transwell y se cultivan hasta que confluyen en la membrana permeable del inserto (Fig. 5a, b). Una vez que se logra la barrera celular después de aproximadamente 4 días de expansión de ISC (células madre intestinales), se cambia el medio para promover la diferenciación en el linaje de absorción primario del colon y el tipo de célula más expuesta a las toxinas de C. difficile48,49,50. Las proteínas de unión estrecha están reguladas positivamente, lo que aumenta la función de barrera de la monocapa celular y disminuye el flujo de iones, que se mide como Resistencia Eléctrica Transepitelial (TEER)51. La toxicidad se mide a lo largo del tiempo como una caída en TEER que indica cambios dependientes de TcdA en el citoesqueleto, que causan uniones estrechas con fugas. Para el cribado rápido, los péptidos se preincubaron con monocapas epiteliales de colon diferenciadas durante 2 horas, luego se añadió TcdA a una concentración de 30 pM, que es la concentración observada en las heces de pacientes con C. diff51. SA1 demostró algunas capacidades neutralizantes en la pantalla primaria como se observa mediante la preservación de TEER en comparación con condiciones con TcdA sin SA1. Debido a que SA1 mostró una actividad neutralizante prometedora, se probó más exhaustivamente su eficacia utilizando el mismo ensayo de toxicidad de TcdA. Como se esperaba, las monocapas de colon respondieron con una pérdida casi completa de TEER 12 horas después de la exposición a TcdA; sin embargo, la exposición previa de las monocapas con SA1 produjo aproximadamente un 79% de protección contra la toxicidad de TcdA (Fig. 5c). Estos datos demuestran la capacidad de SA1 para proteger la función de barrera en presencia de concentraciones clínicamente relevantes de TcdA.

a Resumen del diseño experimental y esquema de la expansión de ISC humana en medios definidos (EM) de monocapas epiteliales del colon humano en transwells (a). Diferenciación forzada con medios definidos (DM) (b). c Mediciones de TEER en monocapas de Colon diferenciado (descendente) tratadas con DM (medio con vehículo), TcdA y TcdA con SA1. Los valores se expresan como % de TEER en t = 0 cuando se añadió TcdA a los cultivos. ANOVA unidireccional p < 0,005, pruebas de comparaciones múltiples 12 h-20 hp < 0,05.

Se utilizó resonancia de plasmón superficial para medir los parámetros cinéticos clave para la unión de SA1:TcdA. SA1 se unió covalentemente a una monocapa autoensamblada (SAM) de tiol biorresistente mixta en la superficie del sensor de oro. La caracterización del espesor y la composición de la superficie se puede encontrar en la Nota complementaria 6, Figs. 5–7. Se inyectaron varias concentraciones del analito, TcdA, sobre la superficie y se registró la respuesta angular neta en grados. La cantidad de analito, TcdA, unido a la superficie se calculó utilizando un factor de conversión específico del dispositivo descrito anteriormente52. La respuesta de equilibrio neto se ajustó a una isoterma de Langmuir (Ec. 1) como se muestra en la Fig. 6a, lo que resultó en una constante de disociación de equilibrio, KD, de 56,1 ± 29,8 nM y una capacidad de unión máxima, Qmax, de 12,0 ± 2,2 nmol/ m2.

a La adsorción máxima de TcdA y la concentración de TcdA se ajustan a una isoterma de Langmuir (Ec. 1) que produce KD y Qmax. b Respuesta dinámica experimental (líneas continuas negras), ajuste teórico individual (líneas discontinuas negras) y ajuste teórico promedio (líneas grises continuas, intervalo de confianza del 95 % en gris claro) para concentraciones de TcdA por encima, por debajo y aproximadamente en KD.

La unión de SA1:TcdA es una interacción de afinidad de moderada a alta basada en su KD nanomolar medio. Una imagen más completa de la unión surge al considerar la cinética además del estado de equilibrio. El reconocimiento rápido, que se caracteriza por una alta constante de velocidad de adsorción (ka), es importante en el contexto de inhibidores competitivos. Además, se desea una estabilidad compleja, como se refleja en una constante de velocidad de desorción (kd) baja. Para tener éxito como un potente inhibidor competitivo de TcdA, SA1 necesita superar a la UDP-glucosa por el sitio activo y disociarse lentamente de él. Las mediciones de respuesta dinámica sobre inyecciones de TcdA permitieron el cálculo de ka y KD utilizando la ecuación. 2, que se resumen en la Tabla 2 y se muestran en la Fig. 6b.

Se encontró que el ka promedio era 7,0 ± 2,5 × 10-5 nmol-1 s-1, que es alto para un inhibidor peptídico, dada su relativa flexibilidad de la columna vertebral. La revisión de la literatura indica que las constantes de la tasa de adsorción de inhibidores de péptidos generalmente caen entre 10-7 y 10-6 nmol-1 s-1 53,54. Se encontró que el kd promedio era 4,0 ± 1,4 × 10−3 s−1, lo que es consistente con el de otros ligandos peptídicos53,54,55,56,57. En comparación con las interacciones de unión anticuerpo:antígeno, que se sabe que tienen una alta afinidad (las KD típicas están entre 10-8 y 10-11 M), SA1:TcdA (KD ~ 10-8 M) exhibe una afinidad de unión notablemente alta por elementos que no son anticuerpos. : bioreconocimiento de antígenos58.

El objetivo de este trabajo fue identificar candidatos a péptidos líderes que se unen al sitio catalítico del dominio de glucosiltransferasa TcdA y, por lo tanto, pueden inhibir la actividad glucosiltransferasa de la toxina TcdA. En nuestro trabajo anterior, informamos péptidos de 10 unidades que pudieron neutralizar TcdA en células absorbentes diferenciadas del intestino delgado (SI), pero no mostraron ningún efecto en las células absorbentes diferenciadas del colon. Una explicación probable para esta observación es que las proteasas presentes en el borde en cepillo de las células SI escindieron los péptidos de 10 unidades en formas más cortas y más activas que neutralizan las toxinas en las células SI. Para investigar esta posibilidad, realizamos espectrofotometría de masas en los medios que contienen el péptido de referencia de 10 unidades (EGWHAHTGGG40) que se había incubado con células SI. Después de 20 horas de exposición a las células SI, el péptido de referencia mostró 4 péptidos predominantes y más pequeños y el péptido de referencia de 10 unidades de longitud completa fue la especie menos abundante, lo que sugiere que las proteasas SI estaban escindiendo el 10 unidades (Figura complementaria 8). . No esperaríamos este efecto en las células del colon, ya que generalmente no expresan proteasas42. Realizamos simulaciones de dinámica molecular atomística para probar si los péptidos más cortos podrían ser inhibidores más eficaces de C. diff. TcdA que los 10-mers. Las simulaciones predijeron que los péptidos de 8 unidades tienen una longitud peptídica óptima. Aplicamos nuestro algoritmo PepBD y lo combinamos con simulaciones de dinámica molecular y cálculos de energía libre de unión para encontrar siete péptidos de 8 unidades (SA1-SA7). Estos péptidos se examinaron rápidamente utilizando una técnica de detección de microfluidos basada en perlas para verificar la unión selectiva de TcdA-GTD, y se eliminaron los inhibidores de péptidos débiles (SA5-SA7). Las eficacias de los péptidos SA1-SA4 se probaron utilizando un ensayo de resistencia eléctrica transepitelial (TEER) en monocapas de células madre epiteliales del intestino humano del intestino grueso (colon descendente). El péptido SA1 bloqueó la toxicidad de TcdA en las células epiteliales del colon. La afinidad de unión de este péptido a TcdA se caracterizó mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) y se encontró que la constante de disociación, KD, era 56,1 ± 29,8 nM.

Uno de nuestros objetivos futuros es desarrollar inhibidores peptídicos que se unan al sitio catalítico de TcdB GTD, ya que TcdB es un objetivo aún más desafiante y clínicamente relevante que TcdA. Evaluamos computacionalmente la afinidad de unión de SA1 por TcdB GTD (método resumido en la Nota complementaria 7). Nuestras predicciones computacionales sugieren que el péptido SA1 exhibe una baja afinidad de unión (\({{{{{\boldsymbol{\triangle }}}}}}{G}_{{binding}}=-1.56{kcal}/{mol}\ )) para el sitio catalítico TcdB GTD. Por tanto, SA1 es selectivo hacia Tcd A.

Los fármacos antitoxinas (como el SA1 desarrollado aquí) son terapéuticamente relevantes porque eliminan el agente causante de la enfermedad (p. ej., la toxina). Los medicamentos antitoxinas también son atractivos porque son altamente específicos (lo que limita los efectos no deseados sobre el huésped o la microbiota) e imponen un costo de aptitud bajo, si es que alguno, al patógeno que produce la toxina (reduciendo así la presión para que se desarrolle resistencia). De esta manera, los fármacos antitoxinas son complementarios (y potencialmente sinérgicos) con los antibióticos habituales. Al unirse al sitio catalítico de la toxina, SA1 inhibe competitivamente la reacción bioquímica clave que causa enfermedades empleada por C. diff. Además, debido a que el sitio activo de la toxina es la región más conservada de la toxina, esperamos que SA1 esté activo en una variedad de cepas de C. diff y mantenga una actividad sólida a medida que surjan nuevas cepas. SA1 representa una mejora en la terapia con péptidos anti-TcdA GTD que es igualmente potente, pero mecánicamente distinta de los inhibidores de glucosiltransferasa de molécula pequeña publicados recientemente59,60. De cara al futuro, la facilidad con la que se pueden fabricar péptidos a escala promete mejorar la equidad del acceso a terapias antitoxinas y también permite fabricarlos en el lugar de la enfermedad mediante microbios intestinales diseñados. En conjunto, este trabajo ilustra un enfoque racional guiado por la estructura para diseñar péptidos antitoxinas que sea fácilmente generalizable a otras toxinas secretadas por C. diff y otros patógenos resistentes a los antibióticos.

N, N-dimetilformamida (DMF), diclorometano (DCM), Alexa Fluor 594 NHS Ester, N-hidroxisuccinimida (NHS), clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), cloruro de sodio, grado HPLC acetonitrilo, ácido fórmico de grado HPLC, acetonitrilo de grado LCMS, ácido fórmico de grado LCMS, columnas de eliminación de tinte Pierce™, ácido acético glacial y ácido clorhídrico se adquirieron de ThermoFisher Scientific (Waltham, MA). Triisopropilsilano-silano (TIS), hidróxido de sodio (NaOH), solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4, 1,2-etanoditiol (EDT), Tween 20, tioanisol, fenol, filtros centrífugos Amicon Ultra de 3 kDa MWCO y glucosa- El conjugado UDP-fluoresceína se adquirió de Millipore-Sigma (Burlington, MA). Se adquirieron peróxido de hidrógeno al 30%, kits de prueba Kaiser y cloruro de magnesio de Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Se adquirió ácido sulfúrico al 96 % de Macron Fine Chemicals (Randor, PA). El éter de petróleo y el éter etílico se adquirieron en EMD Millipore Corporation (Darmstadt, Alemania). Tris HCl se adquirió de IBI Scientific (Peosta, IA). Piperidina, diisopropiletilamina (DIPEA), ácido trifluoroacético (TFA), 1-metil-2-pirrolidinona (NMP), hexafluorofosfato de 2-(7-aza-1Hbenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HATU ), resina Fmoc-L-Arg(Pbf)-Wang, resina Fmoc-L-Trp(Boc)-Wang, resina Fmoc-L-Thr(tBu)-Wang, resina Fmoc-L-Pro-Wang, Fmoc-L La resina -Asn(Trt)-Wang, la resina Rink-Amide y todos los aminoácidos protegidos con Fmoc se adquirieron de ChemImpex, Inc. (Wood Dale, IL). La resina ChemMatrix Aminomethyl (densidad funcional de 0,7 mmol / g, malla 100–200) se adquirió de PCAS Biomatrix, Inc. (Saint-Jean-sur-Richelieu, Quebec, Canadá). La toxina A de Clostridioides difficile se adquirió de List Biological Labs, Inc. (Campbell, CA). Alcanotioles biorresistentes terminados en hidroxilo (HSC11(EG)3OH, 2-{2-[2-(1-mercaptoundec-11-iloxi)-etoxi]-etoxi}-etanol) y terminados en carboxilo (HSC11(EG)6OCH2COOH, (2- (ácido 2-(2-(2-(2-(2-(11-mercaptoundeciloxi)-etoxi)-etoxi)-etoxi)-etoxi)-etoxi-acético)) se obtuvieron de Prochimia Surfaces (Polonia). Los portaobjetos se obtuvieron de BioNavis Ltd. (Tampere, Finlandia). El etanol (prueba 200) se obtuvo de Decon Labs, Inc (King of Prussia, PA). El agua Milli-Q (agua MQ, resistividad > 18 MΩ cm) se obtuvo mediante utilizando un sistema de purificación de agua Millipore (Billerica, MA). El nitrógeno gaseoso y el nitrógeno líquido se obtuvieron de Airgas National Welders (Raleigh, NC).

El algoritmo PepBD utiliza un procedimiento iterativo que optimiza secuencias peptídicas para unirse con mayor afinidad y especificidad a un objetivo biomolecular que un ligando de referencia conocido. El proceso de diseño se resume a continuación.

Generar péptido de entrada: estructura de TcdA GTD: la estructura de entrada para el algoritmo PepBD fue un fragmento de 8 unidades de un péptido in silico, NPA, identificado anteriormente y verificado experimentalmente para neutralizar TcdA en células de yeyuno formando complejos con TcdA GTD.

Calcule la puntuación inicial del péptido aleatorio: Estructura de TcdA: se genera una secuencia peptídica aleatoria y se coloca sobre la estructura principal del péptido inicial (NPA 8-mer) unido al TcdA GTD y su \({\varGamma }_{{score} }\) es calculado.

Iteración de movimientos de cambio de secuencia de péptidos y cambio de conformación: el algoritmo de diseño realiza 10.000 pasos de evolución y genera variantes del péptido original que se unen a la proteína objetivo mediante dos tipos de movimientos: cambio de secuencia (mutación) y cambio de conformación.

Evaluar la puntuación \({\varGamma }_{{score}}\) de la nueva secuencia/conformador peptídico: se evalúa la puntuación de la secuencia peptídica o el confórmero recién generado en complejo con TcdA GTD. La función de puntuación, Γscore, que utilizamos para evaluar los péptidos candidatos recién generados viene dada por:

El primer término de la ecuación. (3), \(\Delta {E}_{{binding}}\), explica la diferencia en la energía del complejo y las energías del péptido y la biomolécula objetivo antes de la unión. El segundo término es el término de estabilidad del péptido y representa la energía del péptido libre en la configuración del estado unido. λ es un factor de ponderación para el término de estabilidad del péptido con un valor de 0,01. Puntuaciones más bajas significan mejores aglutinantes. Los parámetros del campo de fuerza se toman del campo de fuerza Amber 14SB.

Algoritmo de Monte Carlo Metropolis: El algoritmo de Monte Carlo Metropolis se utiliza para aceptar o rechazar nuevos péptidos de prueba.

Se pueden encontrar más detalles sobre el algoritmo PepBD y \({\varGamma }_{{score}}\) en nuestro trabajo anterior26,27,28,29.

Se llevan a cabo simulaciones de MD atomísticas con solvente explícito en el conjunto canónico (NVT) utilizando el paquete AMBER 18 para investigar la dinámica del proceso de unión entre las secuencias peptídicas y el TcdA GTD. Las configuraciones iniciales de los complejos péptido:TcdA GTD en cada simulación de MD son el resultado de las búsquedas en el algoritmo PepBD. Realizamos tres simulaciones independientes para cada péptido: complejo TcdA GTD durante 100 ns para asegurar que el sistema alcanza un estado de equilibrio. Cada complejo péptido-receptor se solvata en una caja octaédrica truncada periódicamente que contiene un tampón de 12 Å de agua TIP3P (\(\sim\) 36.000 moléculas de agua) que rodea el complejo en cada dirección. Se agregaron contraiones como Na+ o Cl- para neutralizar el complejo péptido:proteína antes de ejecutar las simulaciones MD. No se agregaron iones de sal adicionales. El enfoque de mecánica molecular de disolvente implícito/área de superficie de Born generalizada (MM/GBSA) con el modelo de constante dieléctrica interna variable se utiliza para analizar posteriormente las trayectorias de simulación de los últimos 5 ns de los complejos péptido:TcdA GTD para calcular las energías libres de unión. Los detalles de los procedimientos computacionales y el análisis posterior de las simulaciones atomísticas de MD se pueden encontrar en nuestro trabajo anterior26,27,28,29,30,31. Los parámetros de simulación MD se describen en la Tabla complementaria 7.

SA1-SA7, NPA (8 unidades) y RP (8 unidades) se sintetizaron en resina ChemMatrix Aminomethyl siguiendo un conector GSG en un sintetizador de péptidos Biotage Syro I (Biotage, Uppsala, Suecia) siguiendo la estrategia de protección Fmoc/tBu. El conector GSG ayuda a mostrar el péptido en la superficie de la resina. La resina se hinchó en DMF durante 30 min. Los aminoácidos se acoplaron incubando la resina con 3 equivalentes (en relación con la densidad funcional de la resina) de aminoácidos protegidos, 3 eq. HATU y 6 eq. DIPEA en DMF seco durante 15 minutos a 45 °C. El acoplamiento de cada aminoácido se controló mediante la prueba de Kaiser. La eliminación de la resina con Fmoc y después de cada conjugación de aminoácidos se realizó utilizando 5 ml de piperidina al 20% v/v en DMF a temperatura ambiente durante 3 minutos y luego nuevamente durante 10 minutos. La resina protegida se almacenó secada bajo nitrógeno a 4ºC. El péptido completo se desprotegió inmediatamente antes de su uso mediante acidólisis incubando la resina en el cóctel de desprotección, Reactivo K, 82,5 % v/v de TFA, 5 % v/v de fenol, 5 % v/v de agua, 5 % v/v de tioanisol, EDT al 2,5% v/v durante 3 horas a temperatura ambiente y bajo mezcla. La resina desprotegida se lavó con DCM, DMF, luego DCM y se secó bajo nitrógeno.

Se analizaron secuencias de péptidos para determinar su unión a TcdA en un sistema interno de imágenes de perlas de microfluidos diseñado originalmente para clasificar bibliotecas de péptidos en fase sólida36,38. La exclusión de un análogo fluorescente del cofactor UDP-Glucosa (UDP-Glucosa-Fluoresceína) del bolsillo de unión de UDP-Glucosa de TcdA se usó como indicador para visualizar la unión del péptido en la posición deseada.

El tampón Tris se eliminó de la solución de TcdA con filtros centrífugos Amicon Ultra de 3 kDa MWCO, a través de 5 rondas de concentración y dilución 10 veces siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. TcdA se marcó con Alexa Fluor 594 mediante química del NHS. Se añadió 1 µl de NHS-Alexa Fluor 594 de 10 mg/ml a 100 µl de TcdA de 1 mg/ml. Después de 1 h de incubación, el tinte no unido se eliminó con columnas de eliminación de tinte Pierce según las instrucciones del fabricante. Se disolvió UDP-glucosa-fluoresceína a 1 mg/ml en PBS, cloruro de magnesio 10 mM (tampón de unión, BB).

La resina se incubó con TcdA marcado fluorescentemente 0,2 µM (TcdA-AF594) durante la noche. Inmediatamente antes de la selección, se añadió UDP-glucosa-fluoresceína a la solución de resina a una concentración final de 0,5 µM durante 15 minutos. La resina se lavó suavemente 4 veces con BB + Tween 20 al 0,2 % (Screening Buffer, SB). Se tomaron imágenes de perlas de resina en los canales rojo y verde del sistema de microfluidos desarrollado previamente36,38. Las perlas se visualizaron en un microscopio de contraste de fase de fluorescencia invertida trinocular motorizado Olympus IX81 equipado con cubos de filtro de croma FITC y RFA8 y se tomaron imágenes con una cámara Hamamatsu C13440. Cada solución de resina se diluyó en exceso de SB antes de cargarla en el dispositivo de microfluidos. Las perlas de resina se hicieron pasar a través de la cámara de imágenes una a la vez y se tomaron imágenes en los canales rojo (TcdA-AF594) y verde (UDP-Glucosa-Fluoresceína). Se tomaron imágenes de aproximadamente 30 perlas individuales de cada secuencia peptídica.

El procesamiento y análisis de imágenes se realizó en las imágenes de los canales rojo y verde para cada cuenta. Debido a que el canal rojo mostraba un halo de fluorescencia prominente, para el análisis se utilizó el percentil 90 de píxeles de la perla. Esto redujo el sesgo de la variación en el centro de la cuenta. Además, la concentración de TcdA utilizada para la incubación se ajustó previamente para permitir un rango de intensidades en el halo, lo que permitió diferenciar entre aglutinantes moderados y fuertes. Se calculó la fluorescencia verde media del área roja del percentil 90 y la fluorescencia verde media del percentil 50 para determinar la exclusión de UDP-glucosa de TcdA. Se calcularon la media y la desviación estándar del percentil 90 del canal rojo y del canal verde.

SA1-SA4 se sintetizaron en resina Wang precargada con el primer aminoácido en un Initiator+ Alstra (Biotage, Uppsala, Suecia) siguiendo la estrategia de protección Fmoc/tBu. La resina Wang precargada se tapó en sus extremos con 1 ml de anhídrido acético 5 M en 2,5 ml de DIPEA 2 M durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los aminoácidos se acoplaron incubando la resina con 5 equivalentes (en relación con la densidad funcional de la resina) de aminoácidos protegidos, 5 eq. HATU y 10 eq. DIPEA en DMF seco durante 5 minutos a 75 °C. El acoplamiento de cada aminoácido se controló mediante la prueba de Kaiser. La eliminación de Fmoc después de cada conjugación de aminoácidos se realizó usando 5 ml de piperidina al 20% v/v en DMF a temperatura ambiente durante 3 minutos y luego nuevamente durante 10 minutos. El péptido completo se escindió y los grupos protectores de la cadena lateral se eliminaron mediante acidólisis incubando la resina en el cóctel de desprotección, Reactivo K, 82,5 % v/v de TFA, 5 % v/v de fenol, 5 % v/v de agua, 5 % v /v de tioanisol, 2,5% v/v EDT durante 3 h a temperatura ambiente y bajo mezcla. El péptido desprotegido disuelto en el cóctel de desprotección se precipitó en éter etílico al 50% v/v y éter de petróleo al 50% v/v (solución de éter) enfriados con hielo. La solución se enfrió a -80 °C durante 30 minutos, se sedimentó y se lavó tres veces con una solución de éter enfriada con hielo. El sedimento peptídico crudo se secó bajo nitrógeno, se redisolvió en acetonitrilo al 50 % v/v y agua al 50 % v/v, y se secó en Biotage V-10 Touch (Biotage, Uppsala, Suecia) antes de la purificación y el análisis.

SA1-SA4 se purificaron mediante cromatografía ultrarrápida en una Isolera Prime (Biotage, Uppsala, Suecia) con una columna Biotage Sfär Bio C18. El péptido crudo se disolvió en acetonitrilo al 10 % v/v, agua al 90 % v/v y ácido fórmico al 0,1 % v/v y se aplicó a una muestra de columna. La cromatografía de fase inversa se realizó con un gradiente de 5% a 70% de acetonitrilo en agua. Como modificador se utilizó ácido fórmico al 0,1%. Las fracciones se recogieron por encima de un umbral de absorbancia de 220 nm y 280 nm. Las fracciones se analizaron mediante LC-MS para identificar y cuantificar el péptido deseado. Se liofilizaron fracciones de péptidos purificados. Para el pulido final, los péptidos se disolvieron en 50% v/v de agua y 50% v/v de acetonitrilo, se esterilizaron por filtración, se dividieron en alícuotas y se liofilizaron.

Selección de donantes: Los intestinos de donantes humanos aptos para trasplantes se obtuvieron de HonorBridge (Durham, Carolina del Norte) y la Oficina de Ética en Investigación Humana de la UNC los eximió de la investigación con sujetos humanos. Los criterios de aceptación de donantes fueron los siguientes: 65 años o menos, solo muerte cerebral, negativo para el virus de la inmunodeficiencia humana, hepatitis, sífilis, tuberculosis o COVID-19, así como sin antecedentes de lesión abdominal grave, cirugía intestinal o cáncer. o quimioterapia. Para todos los estudios se utilizó tejido de colon de un hombre hispano de 34 años. Las ISC de colon de este donante se aislaron de tejidos primarios. Se obtuvieron muestras quirúrgicas de colon humano de donantes en HonorBridge (Durham, Carolina del Norte). Las criptas del colon se eliminaron de la muestra mediante incubación en un tampón quelante durante 75 minutos a 20 °C, seguido de agitación vigorosa en un tubo cónico de 50 ml. El tampón quelante estaba compuesto por EDTA (2 mM), ditiotreitol (DTT, 0,5 mM, recién añadido), Na2HPO4 (5,6 mM), KH2PO4 (8,0 mM), NaCl (96,2 mM), KCl (1,6 mM), sacarosa (43,4 mM). mM), D-sorbitol (54,9 mM), pH 7,4. Las criptas liberadas se expandieron como una monocapa sobre hidrogeles de colágeno neutralizados. Las criptas se colocaron encima de hidrogeles de colágeno de 1 mg/ml (1 ml en cada pocillo de una placa de 6 pocillos) a una densidad de 10.000 criptas/pocillo, recubiertas con 3 ml de medio de expansión (EM)61 que contenía 10 mmol/l. Y-27632 (S1049; SelleckChem, Houston, TX) y se incubaron a 37 °C en 5% de CO2. Se utilizó EM para ampliar el número de células epiteliales como monocapas; El medio se cambió el día después de la siembra y posteriormente cada 48 horas. Cuando la cobertura celular era superior al 80% (normalmente de 4 a 6 días), el epitelio se disociaba en fragmentos62 para sembrar en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos recubiertas con hidrogeles de colágeno para una expansión continua, o en insertos Transwell de 12 pocillos ( 3460; Corning, Corning, NY) recubierto con Matrigel al 1% para experimentos61. Para generar enterocitos diferenciados para los ensayos de toxicidad, se disociaron 2 pocillos de una placa de expansión ISC colónica de 6 pocillos, donde las células tenían aproximadamente un 90 % de confluencia, como se describió anteriormente y se colocaron en placas en insertos Transwell de 12 pocillos recubiertos con Matrigel al 1 %. Las ISC colónicas se expandieron en medios de expansión de colon (EM, ver Ref. 61 para todas las formulaciones de medios) hasta confluencia (~4 días). Después de que las ISC colónicas confluyeron, el medio se cambió a medio de diferenciación (DM) y se midió la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) cada 24 horas utilizando el EVOM2 (World Precision Instruments, FL). A los 3-4 días de diferenciación, cuando el TEER era >1000 ohmios/cm2, se iniciaron los ensayos de toxicidad. Todas las células se incubaron a 37 °C en un ambiente humidificado que contenía 5% de CO2.

Los péptidos se diluyeron a una concentración de 1,0 mM en 500 µl de MS y se añadieron al depósito apical. Se dejó que los péptidos se preincubaran con las monocapas de colon durante 2 horas antes de la adición de TcdA (SML1154; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Se añadió TcdA a una concentración final de 30 pMol directamente al medio del depósito apical que contenía el péptido y se incubó a 37 °C en un ambiente humidificado que contenía 5 % de CO2. Se midió TEER antes y después de aplicar los péptidos. Luego se midió TEER en los momentos indicados.

Se sintetizó el péptido SA1-K-amida modificado para facilitar el injerto en sensores de oro a través del residuo de lisina C-terminal. La funcionalización amida del extremo C impidió la repulsión electrostática entre el extremo C del péptido y los grupos de ácido carboxílico en el SAM. La SA1-K-amida se sintetizó en resina Rink Amide en un Initiator+ Alstra (Biotage, Uppsala, Suecia) siguiendo la estrategia de protección Fmoc/tBu como se describió anteriormente. Se utilizó un cóctel de desprotección modificado, 91,5 % p/p de TFA, 2,5 % p/p de agua, 2,5 % p/p de TIS, 2,5 % p/p de TDT y 1 % p/p de indol. La SA1-K-amida se recogió, purificó y analizó mediante el protocolo descrito anteriormente.

Los portaobjetos de sensor de oro (12 × 20 × 0,5 mm3), oro de 50 nm adherido a sensores de vidrio con cromo de 2 nm, se limpiaron antes de su uso sumergiéndolos en solución Piranha (98% H2SO4 y 30% H2O2 a 3:1 v/v). durante 15 a 20 minutos, seguido de un enjuague profuso en agua MQ, enjuague con etanol de 200 grados y secado bajo una corriente de nitrógeno. Los portaobjetos del sensor de oro se sumergieron brevemente en etanol de 200 grados antes de la modificación. (Advertencia: la solución Piranha reacciona violentamente con materiales orgánicos y debe manipularse con extrema precaución).

Se produjo un SAM de tiol mixto disolviendo HSC11(EG)3OH y HSC11(EG)6OCH2COOH en una relación molar de 3:1, concentración total de 1 mM, en etanol de 200 grados. Los sensores de oro se sumergieron en la solución de tiol bajo nitrógeno y se protegieron de la luz durante 24 h. Las superficies se enjuagaron vigorosamente con etanol de 200 grados para romper las capas múltiples y luego se secaron bajo nitrógeno para la posterior caracterización, injerto de péptidos o experimentos de SPR. El péptido SA1-K-amida modificado se injertó en grupos de ácido carboxílico en el SAM mediante química NHS/EDC. Se aplicaron EDC 200 mM y NHS 50 mM disueltos en agua MQ a las superficies del sensor de oro durante 1 h. Los sensores de oro activado se enjuagaron en agua MQ y se secaron bajo nitrógeno. Se disolvió 1 mg/ml de péptido SA1-K-amida en agua MQ y se conjugó con los sensores de oro activado durante 1 h. Los sensores de oro injertados con péptidos se lavaron en agua MQ y se secaron bajo nitrógeno. Los sitios restantes de ácido carboxílico activado se bloquearon incubando etanolamina 3 M en agua MQ en la superficie de los sensores de oro durante 30 minutos. Los sensores de oro se enjuagaron con agua MQ y se secaron bajo nitrógeno para su posterior caracterización y experimentos de SPR.

El espesor de la superficie del tiol mixto SAM y SAM con péptido injertado SA1 se midió usando un elipsómetro espectroscópico DI M-2000 (JA Woollam, Lincoln, NE) en tres ángulos de incidencia Φ = 55°, 65°, 75°. De abajo hacia arriba, las muestras se modelaron como sustrato Cauchy (vidrio) de 3 mm, cromo de 2 nm y oro de 50 nm según las especificaciones del fabricante. Se estimó que el valor inicial del sustrato de Cauchy (capa de polímero) sobre la superficie de oro era de 25 nm y el espesor de la superficie se midió después de generar el modelo. La interferencia de absorbancia se mitigó condensando el rango de longitud de onda de 600 a 1000 nm.

Caracterización por espectrometría de masas de iones secundarios de tiempo de vuelo (ToF-SIMS) de portaobjetos de sensor de oro con monocapas autoensambladas (SAM) y SA1 injertado covalentemente en SAM. Los experimentos se realizaron en un instrumento TOF SIMS V (ION TOF, Inc., Chestnut Ridge, NY). Se registraron espectros positivos y negativos para SAM y SAM-SA1 de tioles mixtos. Los espectros de masas de iones secundarios positivos se calibraron usando H+, C+, C2H3+, C3H5+ y C4H7+. Los espectros de masas de iones secundarios negativos se calibraron utilizando C-, O-, OH- y Cn-, respectivamente.

Se utilizó un instrumento KSV SPR 200 (BioNavis Instruments, Helsinki, Finlandia) para detectar cambios en el índice de refracción en la interfaz del sensor. Los sensores se equilibraron con 30 µl/min de Tris 50 mM, NaCl 50 mM, MgCl2 10 mM (Running Buffer, RB) durante más de 5 minutos. Después de establecer una línea de base estable, se inyectaron 250 µl de TcdA en RB en diversas concentraciones a 30 µl/min, seguido de RB. Se utilizaron nuevos sensores para cada medición debido a la dificultad para interrumpir la interacción de unión péptido:TcdA.

La constante de disociación de equilibrio, KD, se encontró midiendo el cambio neto de equilibrio en la señal SPR (grados) después de cada inyección de TcdA en concentraciones de aproximadamente 0,1 KD a 10 KD. El cambio neto en grados se convirtió en masa de proteína adsorbida por unidad de área mediante un factor de conversión previamente medido, respuesta de 1 grado = 7,31 mg/m2. Los datos se ajustaron a una isoterma de Langmuir utilizando la masa adsorbida por unidad de área, Q (nmol/m2), y la concentración de TcdA en solución, [TcdA] (nM),

donde KD es la constante de disociación de equilibrio (nM) y Qmax es la capacidad de unión máxima (nmol/m2). Un modelo de Langmuir es apropiado cuando hay una interacción 1:1 entre el ligando y el analito, no hay limitaciones en la transferencia de masa y los eventos de unión son independientes. Suponiendo una unión reversible,

donde ka es la constante de asociación (adsorción) de segundo orden y kd es la constante de disociación (desorción) de primer orden. Suponiendo que no haya limitaciones en la transferencia de masa, la concentración de TcdA en el volumen y en la superficie es igual. La respuesta SPR y la cantidad adsorbida, Q, son proporcionales a la concentración de TcdA unida al péptido, [TcdA•SA1]. La respuesta SPR máxima y la capacidad de unión máxima, Qmax, son proporcionales al ligando unido máximo [TcdA]tot. Sustituyéndolos en la ecuación de tasas se obtiene,

Integrando la ecuación. 6 y sustituyendo por kd,

El primer término de la ecuación. 7 determina el nivel de equilibrio y el segundo término determina el tiempo para alcanzar el equilibrio. La constante de disociación se puede determinar a partir de KD y ka.

Los detalles de los experimentos se proporcionan en el texto principal y en "Métodos". Para el ensayo basado en perlas, se realizaron análisis estadísticos utilizando una prueba T de dos colas junto con el control RP (-T). La significancia se determinó en p <0,05. El número de réplicas para cada muestra fue el siguiente: SA1 (23), SA2 (20), SA3 (25), SA4 (19), SA5 (23), SA6 (21), SA7 (15), NPA (36) , RP (14), RP (-T) (8) y RP (-T-U) (7). Se tomaron imágenes de aproximadamente 40 cuentas para cada muestra, excluyéndose las imágenes que contenían cuentas desenfocadas o agregados de cuentas. Para el ensayo SPR, los datos recopilados fueron generalmente mediciones únicas, excepto dos condiciones (10 nM, n = 2; 25 nM, n = 3). Cada sensor SPR se utilizó para procesar dos muestras a través de dos canales separados, lo que generó un total de 14 mediciones. Sin embargo, una medición fue excluida debido a la pérdida de una señal estable. Las mediciones se realizaron en dos sesiones y en ambas sesiones se repitió una condición (TcdA 25 nM) como control.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos están disponibles en el manuscrito y/o en la información de respaldo. El archivo de topología ámbar y el archivo PDB final de cada ejecución de simulación MD de SA1-SA7, los archivos de datos sin procesar para reproducir gráficos están disponibles en: https://github.com/CarolHall-NCSU-CBE/8-mer-peptides-TcdA.

El código PepBD y el código matlab para el procesamiento de imágenes en el ensayo de perlas están disponibles en: https://github.com/CarolHall-NCSU-CBE/8-mer-peptides-TcdA.

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Descargar referencias

Esta investigación fue apoyada por fondos de la Fundación Nacional de Ciencias (CBET-1934284), de los Institutos Nacionales de Salud (R01DK109559), del Centro de Biotecnología de Carolina del Norte (2019-FLG-3841), Centro de Biología y Enfermedades Gastrointestinales de la UNC, P30DK034987 y de la Fundación Novo Nordisk (AIM-Bio), NNF19SA0035474. Este trabajo utilizó el entorno de descubrimiento de ingeniería y ciencia extrema (XSEDE), apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias (ACI-1548562). S. Sarma, X. Xiao y CK Hall agradecen al Centro de Supercomputación de San Diego (SDSC) por el tiempo de computación.

Estos autores contribuyeron igualmente: Sudeep Sarma, Carly M. Catella.

Departamento de Ingeniería Química, Universidad Estatal de Carolina del Norte, Raleigh, NC, 27695-7905, EE. UU.

Sudeep Sarma, Carly M. Catella, Xingqing Xiao, Deniz Durmusoglu, Stefano Menegatti, Nathan Crook y Carol K. Hall

Departamento de Medicina, Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, Chapel Hill, NC, 27514, EE. UU.

Ellyce T. San Pedro y Scott T. Magness

Centro de Educación y Capacitación en Biofabricación (BTEC), Universidad Estatal de Carolina del Norte, Raleigh, NC, 27695, EE. UU.

Stefano Menegatti

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SS, CMC, XX, DD, SM, NC, STM y CKH diseñaron investigaciones, SS, CMC y ESP realizaron investigaciones, SS, CMC, ESP, SM, NC, STM y CKH analizaron datos, SS, CMC, ESP, SM, NC, STM y CKH escribieron el artículo.

Correspondencia a Carol K. Hall.

SS, CMC, XX, SM, NC, STM y CKH tienen intereses en competencia. SS, CMC, XX, SM, NC, STM y CKH han presentado una solicitud de patente para este trabajo. ESP y DD no tienen intereses en competencia.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal: Gene Chong.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Sarma, S., Catella, CM, San Pedro, ET et al. Diseño de péptidos de 8 unidades que bloquean la toxina A de Clostridioides difficile en las células intestinales. Común Biol 6, 878 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05242-x

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Recibido: 17 de marzo de 2023

Aceptado: 14 de agosto de 2023

Publicado: 26 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05242-x

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